आणविक पहचान विधियों में नमूनों में पाई जाने वाली ट्रेस मात्रा के प्रवर्धन के माध्यम से बड़ी मात्रा में न्यूक्लिक एसिड का उत्पादन करने की क्षमता होती है।जबकि यह संवेदनशील पहचान को सक्षम करने के लिए फायदेमंद है, यह प्रयोगशाला के वातावरण में प्रवर्धन एरोसोल के प्रसार के माध्यम से संदूषण की संभावना का भी परिचय देता है।प्रयोग करते समय, अभिकर्मकों, प्रयोगशाला उपकरणों और बेंच स्पेस के संदूषण से बचने के उपाय किए जा सकते हैं, क्योंकि ऐसे संदूषण गलत-सकारात्मक (या गलत-नकारात्मक) परिणाम उत्पन्न कर सकते हैं।

संदूषण की संभावना को कम करने में मदद के लिए हर समय अच्छे प्रयोगशाला अभ्यास का प्रयोग किया जाना चाहिए।विशेष रूप से, निम्नलिखित बिंदुओं के संबंध में सावधानी बरतनी चाहिए:

1. अभिकर्मकों को संभालना
2. कार्यक्षेत्र और उपकरणों का संगठन
3. निर्दिष्ट आणविक स्थान के लिए उपयोग और सफाई सलाह
4. सामान्य आणविक जीव विज्ञान सलाह
5. आंतरिक नियंत्रण
6. ग्रंथ सूची

1. अभिकर्मकों को संभालना

एरोसोल के उत्पादन से बचने के लिए खोलने से पहले संक्षेप में अभिकर्मक ट्यूबों को अपकेंद्रित करें।विभाज्य अभिकर्मकों कई फ्रीज-गल और मास्टर शेयरों के संदूषण से बचने के लिए।स्पष्ट रूप से सभी अभिकर्मक और प्रतिक्रिया ट्यूबों को लेबल और दिनांकित करें और सभी प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मक लॉट और बैच संख्याओं के लॉग बनाए रखें।फ़िल्टर युक्तियों का उपयोग करके सभी अभिकर्मकों और नमूनों को पिपेट करें।खरीद से पहले, निर्माता के साथ पुष्टि करने की सलाह दी जाती है कि फ़िल्टर युक्तियाँ उपयोग किए जाने वाले पिपेट के ब्रांड में फिट होती हैं।

2. कार्यक्षेत्र और उपकरणों का संगठन

कार्यक्षेत्र को यह सुनिश्चित करने के लिए व्यवस्थित किया जाना चाहिए कि काम का प्रवाह एक दिशा में हो, स्वच्छ क्षेत्रों (पूर्व-पीसीआर) से गंदे क्षेत्रों (पीसीआर के बाद) तक।निम्नलिखित सामान्य सावधानियां संदूषण की संभावना को कम करने में मदद करेंगी।मास्टरमिक्स तैयारी, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और डीएनए टेम्पलेट जोड़, प्रवर्धित उत्पाद का प्रवर्धन और संचालन, और उत्पाद विश्लेषण, जैसे जेल वैद्युतकणसंचलन, के लिए अलग नामित कमरे, या कम से कम शारीरिक रूप से अलग क्षेत्रों में।

कुछ सेटिंग्स में, 4 अलग कमरे रखना मुश्किल होता है।एक संभावित लेकिन कम वांछनीय विकल्प एक नियंत्रण क्षेत्र में मास्टरमिक्स तैयार करना है, उदाहरण के लिए एक लैमिनार फ्लो कैबिनेट।नेस्टेड पीसीआर प्रवर्धन के मामले में, दूसरे दौर की प्रतिक्रिया के लिए मास्टरमिक्स की तैयारी मास्टरमिक्स तैयारी के लिए 'स्वच्छ' क्षेत्र में तैयार की जानी चाहिए, लेकिन प्राथमिक पीसीआर उत्पाद के साथ टीकाकरण प्रवर्धन कक्ष में किया जाना चाहिए, और यदि संभव हो तो एक समर्पित रोकथाम क्षेत्र में (उदाहरण के लिए एक लैमिनार फ्लो कैबिनेट)।

प्रत्येक कमरे/क्षेत्र को स्पष्ट रूप से लेबल किए गए पिपेट, फिल्टर टिप्स, ट्यूब रैक, भंवर, सेंट्रीफ्यूज (यदि प्रासंगिक हो), पेन, जेनेरिक लैब अभिकर्मकों, लैब कोट और दस्ताने के बक्से के एक अलग सेट की आवश्यकता होती है जो उनके संबंधित कार्यस्थानों पर बने रहेंगे।निर्दिष्ट क्षेत्रों के बीच चलते समय हाथों को धोना चाहिए और दस्ताने और लैब कोट बदलना चाहिए।अभिकर्मकों और उपकरणों को गंदे क्षेत्र से साफ क्षेत्र में नहीं ले जाना चाहिए।यदि कोई चरम मामला उत्पन्न होता है जहां एक अभिकर्मक या उपकरण के टुकड़े को पीछे की ओर ले जाने की आवश्यकता होती है, तो इसे पहले 10% सोडियम हाइपोक्लोराइट से कीटाणुरहित किया जाना चाहिए, इसके बाद जीवाणुरहित पानी से पोंछ देना चाहिए।

टिप्पणी

10% सोडियम हाइपोक्लोराइट घोल को रोजाना ताजा बनाया जाना चाहिए।परिशोधन के लिए उपयोग किए जाने पर, 10 मिनट के न्यूनतम संपर्क समय का पालन किया जाना चाहिए।
वैकल्पिक रूप से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पाद जो डीएनए को नष्ट करने वाले सतह विसंदूषक के रूप में मान्य हैं, का उपयोग किया जा सकता है यदि स्थानीय सुरक्षा सिफारिशें सोडियम हाइपोक्लोराइट के उपयोग की अनुमति नहीं देती हैं या यदि सोडियम हाइपोक्लोराइट उपकरण के धातु भागों को कीटाणुरहित करने के लिए उपयुक्त नहीं है।

आदर्श रूप से, कर्मचारियों को एक दिशा वाले कार्य प्रवाह लोकाचार का पालन करना चाहिए और उसी दिन गंदे क्षेत्रों (पीसीआर के बाद) से वापस स्वच्छ क्षेत्रों (पीसीआर से पहले) में नहीं जाना चाहिए।हालाँकि, ऐसे अवसर हो सकते हैं जब यह अपरिहार्य हो।जब ऐसा अवसर आता है, तो कर्मियों को अच्छी तरह से हाथ धोने, दस्ताने बदलने, निर्दिष्ट लैब कोट का उपयोग करने और प्रयोगशाला की किताबों जैसे किसी भी उपकरण को कमरे से बाहर ले जाने से बचना चाहिए।आण्विक तरीकों पर कर्मचारियों के प्रशिक्षण में ऐसे नियंत्रण उपायों पर जोर दिया जाना चाहिए।

उपयोग के बाद, बेंच स्पेस को 10% सोडियम हाइपोक्लोराइट (अवशिष्ट ब्लीच को हटाने के लिए बाँझ पानी के बाद), 70% इथेनॉल, या एक मान्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए-नष्ट करने वाले कीटाणुनाशक से साफ किया जाना चाहिए।आदर्श रूप से, विकिरण द्वारा परिशोधन को सक्षम करने के लिए अल्ट्रा-वायलेट (यूवी) लैंप लगाए जाने चाहिए।हालांकि, प्रयोगशाला कर्मचारियों के यूवी जोखिम को सीमित करने के लिए यूवी लैंप का उपयोग बंद कार्य क्षेत्रों, जैसे सुरक्षा अलमारियाँ तक सीमित होना चाहिए।यूवी लैंप की देखभाल, वेंटिलेशन और सफाई के लिए कृपया निर्माता के निर्देशों का पालन करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि लैंप प्रभावी रहें।

यदि सोडियम हाइपोक्लोराइट के बजाय 70% इथेनॉल का उपयोग किया जाता है, तो परिशोधन को पूरा करने के लिए यूवी प्रकाश के साथ विकिरण की आवश्यकता होगी।
सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ भंवर और सेंट्रीफ्यूज को साफ न करें;इसके बजाय, 70% इथेनॉल के साथ मिटा दें और यूवी प्रकाश को बेनकाब करें, या एक वाणिज्यिक डीएनए-नष्ट करने वाले परिशोधक का उपयोग करें।छलकने के लिए, आगे की सफाई सलाह के लिए निर्माता से संपर्क करें।यदि निर्माता निर्देश इसकी अनुमति देते हैं, तो पिपेट को आटोक्लेव द्वारा नियमित रूप से निष्फल किया जाना चाहिए।यदि पिपेट्स को ऑटोक्लेव नहीं किया जा सकता है, तो उन्हें 10% सोडियम हाइपोक्लोराइट (इसके बाद बाँझ पानी से पूरी तरह से मिटा दिया जाता है) या एक वाणिज्यिक डीएनए-नष्ट करने वाले कीटाणुनाशक के साथ यूवी जोखिम के साथ साफ करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए।

उच्च प्रतिशत सोडियम हाइपोक्लोराइट से सफाई नियमित रूप से करने पर पिपेट प्लास्टिक और धातुओं को नुकसान पहुंचा सकती है;पहले निर्माता की सिफारिशों की जाँच करें।निर्माता द्वारा अनुशंसित अनुसूची के अनुसार सभी उपकरणों को नियमित रूप से कैलिब्रेट करने की आवश्यकता होती है।एक नामित व्यक्ति को यह सुनिश्चित करने का प्रभारी होना चाहिए कि अंशांकन अनुसूची का पालन किया जाता है, विस्तृत लॉग बनाए जाते हैं, और सेवा लेबल उपकरण पर स्पष्ट रूप से प्रदर्शित होते हैं।

3. निर्दिष्ट आणविक स्थान के लिए उपयोग और सफाई सलाह

प्री-पीसीआर: रिएजेंट एलिकोटिंग / मास्टरमिक्स तैयारी: यह आणविक प्रयोगों की तैयारी के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी स्थानों में से सबसे साफ होना चाहिए और आदर्श रूप से यूवी प्रकाश से लैस एक नामित लामिनार प्रवाह कैबिनेट होना चाहिए।इस क्षेत्र में नमूने, निकाले गए न्यूक्लिक एसिड और प्रवर्धित पीसीआर उत्पादों को संभालना नहीं चाहिए।प्रवर्धन अभिकर्मकों को एक फ्रीजर (या रेफ्रिजरेटर, निर्माता की सिफारिशों के अनुसार) में एक ही निर्दिष्ट स्थान पर रखा जाना चाहिए, आदर्श रूप से लैमिनार फ्लो कैबिनेट या प्री-पीसीआर क्षेत्र के बगल में।प्री-पीसीआर क्षेत्र या लैमिनार फ्लो कैबिनेट में प्रवेश करने पर हर बार दस्ताने बदलने चाहिए।

प्री-पीसीआर क्षेत्र या लामिनार फ्लो कैबिनेट को उपयोग से पहले और बाद में निम्नानुसार साफ किया जाना चाहिए: कैबिनेट में सभी वस्तुओं को साफ करें, जैसे कि पिपेट, टिप बॉक्स, वोर्टेक्स, सेंट्रीफ्यूज, ट्यूब रैक, पेन आदि को 70% इथेनॉल या ए वाणिज्यिक डीएनए-नष्ट करनेवाला परिशोधक, और सूखने की अनुमति दें।एक बंद कार्य क्षेत्र के मामले में, उदाहरण के लिए एक लैमिनार फ्लो कैबिनेट, 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश में हुड को उजागर करें।

टिप्पणी

यूवी प्रकाश के लिए अभिकर्मकों का पर्दाफाश न करें;एक बार साफ होने के बाद ही उन्हें कैबिनेट में ले जाएं।यदि रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर का प्रदर्शन किया जाता है, तो सतहों और उपकरणों को एक समाधान के साथ पोंछने में भी मददगार हो सकता है जो संपर्क पर आरएनएएस को तोड़ देता है।यह आरएनए के एंजाइम अवक्रमण से गलत-नकारात्मक परिणामों से बचने में मदद कर सकता है।कीटाणुशोधन के बाद और मास्टरमिक्स तैयार करने से पहले, दस्ताने को एक बार और बदलना चाहिए, और फिर कैबिनेट उपयोग के लिए तैयार है।

प्री-पीसीआर: न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण/टेम्प्लेट जोड़ना:

न्यूक्लिक एसिड को पिपेट, फिल्टर टिप्स, ट्यूब रैक, फ्रेश ग्लव्स, लैब कोट और अन्य उपकरणों के एक अलग सेट का उपयोग करके दूसरे निर्दिष्ट क्षेत्र में निकाला और संभाला जाना चाहिए। यह क्षेत्र टेम्प्लेट, नियंत्रण और ट्रेंडलाइन को जोड़ने के लिए भी है। Mastermix ट्यूब या प्लेटें।निकाले गए न्यूक्लिक एसिड के नमूनों के संदूषण से बचने के लिए जिनका विश्लेषण किया जा रहा है, सकारात्मक नियंत्रण या मानकों को संभालने से पहले दस्ताने बदलने और पिपेट के एक अलग सेट का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।इस क्षेत्र में पीसीआर अभिकर्मकों और प्रवर्धित उत्पादों को पिपेट नहीं किया जाना चाहिए।नमूनों को उसी क्षेत्र में नामित फ्रिज या फ्रीजर में संग्रहित किया जाना चाहिए।नमूना कार्यक्षेत्र को मास्टरमिक्स स्थान की तरह ही साफ किया जाना चाहिए।

पोस्ट-पीसीआर: प्रवर्धित उत्पाद का प्रवर्धन और प्रबंधन

यह निर्दिष्ट स्थान प्रवर्धन के बाद की प्रक्रियाओं के लिए है और पूर्व-पीसीआर क्षेत्रों से शारीरिक रूप से अलग होना चाहिए।इसमें आमतौर पर थर्मोसाइकिलर और रीयल-टाइम प्लेटफॉर्म शामिल होते हैं, और यदि नेस्टेड पीसीआर का प्रदर्शन किया जा रहा है, तो आदर्श रूप से राउंड 1 पीसीआर उत्पाद को राउंड 2 प्रतिक्रिया में जोड़ने के लिए एक लैमिनार फ्लो कैबिनेट होना चाहिए।पीसीआर अभिकर्मकों और निकाले गए न्यूक्लिक एसिड को इस क्षेत्र में संभाला नहीं जाना चाहिए क्योंकि संदूषण का खतरा अधिक होता है।इस क्षेत्र में दस्ताने, लैब कोट, प्लेट और ट्यूब रैक, पिपेट, फिल्टर टिप्स, डिब्बे और अन्य उपकरण का एक अलग सेट होना चाहिए।खोलने से पहले ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज किया जाना चाहिए।नमूना कार्यक्षेत्र को मास्टरमिक्स स्थान की तरह ही साफ किया जाना चाहिए।

पोस्ट-पीसीआर: उत्पाद विश्लेषण

यह कमरा उत्पाद का पता लगाने वाले उपकरणों के लिए है, जैसे जेल वैद्युतकणसंचलन टैंक, पावर पैक, यूवी ट्रांसिल्यूमिनेटर और जेल प्रलेखन प्रणाली।इस क्षेत्र में दस्ताने, लैब कोट, प्लेट और ट्यूब रैक, पिपेट, फिल्टर टिप्स, डिब्बे और अन्य उपकरण के अलग-अलग सेट होने चाहिए।लोडिंग डाई, आणविक मार्कर और एग्रोस जेल और बफर घटकों को छोड़कर, इस क्षेत्र में कोई अन्य अभिकर्मक नहीं लाया जा सकता है।नमूना कार्यक्षेत्र को मास्टरमिक्स स्थान की तरह ही साफ किया जाना चाहिए।

महत्वपूर्ण लेख

आदर्श रूप से, प्री-पीसीआर कक्षों में उसी दिन प्रवेश नहीं किया जाना चाहिए, यदि पोस्ट-पीसीआर कक्षों में पहले ही कार्य किया जा चुका है।यदि यह पूरी तरह से अपरिहार्य है, तो सुनिश्चित करें कि हाथों को पहले अच्छी तरह से धोया जाता है और कमरे में विशिष्ट लैब कोट पहने जाते हैं।लैब की किताबें और कागजी कार्रवाई को प्री-पीसीआर रूम में नहीं ले जाना चाहिए, अगर उनका इस्तेमाल पोस्ट-पीसीआर रूम में किया गया हो;यदि आवश्यक हो, तो प्रोटोकॉल/नमूना आईडी आदि का डुप्लीकेट प्रिंट-आउट लें।

4. सामान्य आणविक जीव विज्ञान सलाह

परख निषेध से बचने के लिए पाउडर मुक्त दस्ताने का प्रयोग करें।संदूषण को कम करने के लिए सही पाइपिंग तकनीक सर्वोपरि है।तरल पदार्थ का वितरण और एरोसोल के निर्माण के दौरान गलत पिपेटिंग के परिणामस्वरूप छींटे पड़ सकते हैं।सही पिपेटिंग के लिए अच्छा अभ्यास निम्नलिखित लिंक्स पर पाया जा सकता है: गिलसन गाइड टू पिपेटिंग, एनाकेम पिपेटिंग तकनीक वीडियो, खोलने से पहले सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, और छिड़काव से बचने के लिए उन्हें सावधानी से खोलें।दूषित पदार्थों की शुरूआत से बचने के लिए उपयोग के तुरंत बाद ट्यूबों को बंद कर दें।

कई प्रतिक्रियाएं करते समय, अभिकर्मक स्थानांतरण की संख्या को कम करने और संदूषण के खतरे को कम करने के लिए सामान्य अभिकर्मकों (जैसे पानी, dNTPs, बफर, प्राइमर और एंजाइम) युक्त एक मास्टरमिक्स तैयार करें।बर्फ या ठंडे ब्लॉक पर मास्टरमिक्स स्थापित करने की सिफारिश की जाती है।हॉट स्टार्ट एंजाइम का उपयोग गैर-विशिष्ट उत्पादों के उत्पादन को कम करने में मदद कर सकता है।गिरावट से बचने के लिए प्रकाश से फ्लोरोसेंट जांच वाले अभिकर्मकों को सुरक्षित रखें।

5. आंतरिक नियंत्रण

सभी प्रतिक्रियाओं में नो-टेम्प्लेट नियंत्रण के साथ-साथ मात्रात्मक प्रतिक्रियाओं के लिए एक बहु-बिंदु अनुमापन ट्रेंडलाइन के साथ-साथ अच्छी तरह से विशेषता, पुष्टि सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण शामिल करें।सकारात्मक नियंत्रण इतना मजबूत नहीं होना चाहिए कि इससे संदूषण का खतरा हो।न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण करते समय सकारात्मक और नकारात्मक निष्कर्षण नियंत्रण शामिल करें।

यह अनुशंसा की जाती है कि प्रत्येक क्षेत्र में स्पष्ट निर्देश पोस्ट किए जाएं ताकि उपयोगकर्ता आचरण के नियमों से अवगत हों।क्लिनिकल नमूनों में डीएनए या आरएनए के बहुत कम स्तर का पता लगाने वाली नैदानिक ​​प्रयोगशालाएं प्री-पीसीआर कमरों में थोड़ा सकारात्मक वायु दबाव और पोस्ट-पीसीआर कमरों में थोड़ा नकारात्मक वायु दबाव के साथ अलग एयर हैंडलिंग सिस्टम के अतिरिक्त सुरक्षा उपाय को अपनाना चाह सकती हैं।

अंत में, गुणवत्ता आश्वासन (क्यूए) योजना विकसित करना सहायक होता है।इस तरह की योजना में अभिकर्मक मास्टर स्टॉक और वर्किंग स्टॉक की सूची, किट और अभिकर्मकों के भंडारण के नियम, नियंत्रण परिणामों की रिपोर्टिंग, स्टाफ प्रशिक्षण कार्यक्रम, समस्या निवारण एल्गोरिदम और आवश्यकता पड़ने पर उपचारात्मक कार्रवाई शामिल होनी चाहिए।

6. ग्रंथ सूची

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