Loaʻa i nā ʻano molecular detection ka hiki ke hana i ka nui o ka nucleic acid ma o ka hoʻonui ʻana i nā nui trace i loaʻa i nā laʻana.ʻOiai he mea maikaʻi kēia no ka ʻae ʻana i ka ʻike koʻikoʻi, hoʻolauna pū ia i ka hiki ke hoʻohaumia ʻia ma o ka hoʻolaha ʻana o nā aerosol amplification i loko o ke kaiapuni keʻena.I ka wā e hana ai i nā hoʻokolohua, hiki ke hana ʻia nā hana e pale aku ai i ka hoʻohaumia ʻana o nā reagents, nā mea hana hale hana a me nā wahi noho, no ka mea hiki ke hoʻopuka ʻia nā hopena maikaʻi ʻole (a i ʻole hoʻopunipuni).

No ke kōkua ʻana i ka hōʻemi ʻana i ka hiki ke hoʻohaumia ʻia, pono e hoʻomaʻamaʻa ʻia ka Good Laboratory Practice i nā manawa āpau.ʻO ke kikoʻī, pono e mālama ʻia e pili ana i kēia mau mea:

1. Ka lawelawe ʻana i nā reagents
2. Hoʻonohonoho i ka lumi hana a me nā mea hana
3. Hoʻohana a hoʻomaʻemaʻe i ka ʻōlelo aʻoaʻo no ka wahi molekala i koho ʻia
4. Nā ʻōlelo aʻoaʻo biology molecular maʻamau
5. Nā mana o loko
6. Palapala Palapala

1. Ka lawelawe ʻana i nā reagents

E hoʻokahe pōkole i nā paipu reagent ma mua o ka wehe ʻana e pale i ka hana ʻana o nā aerosol.ʻO Aliquot reagents e pale aku i ka nui o ka freeze-thaws a me ka haumia o nā kumu waiwai.E hoʻopaʻa inoa a hoʻopaʻa i ka lā i nā paipu reagent a pau a mālama i nā moʻolelo o ka hailona reagent a me nā helu hui i hoʻohana ʻia i nā hoʻokolohua āpau.Pipette i nā reagents a me nā laʻana me ka hoʻohana ʻana i nā ʻōlelo aʻoaʻo kānana.Ma mua o ke kūʻai ʻana, ʻoi aku ka maikaʻi e hōʻoia me ka mea hana e kūpono nā ʻōkuhi kānana i ka brand pipette e hoʻohana ʻia.

2. Hoʻonohonoho i ka lumi hana a me nā mea hana

Pono e hoʻonohonoho ʻia ka lumi hana e hōʻoia i ka holo ʻana o ka hana ma kahi ʻaoʻao, mai nā wahi maʻemaʻe (pre-PCR) a i nā wahi lepo (post-PCR).E kōkua kēia mau ʻōlelo hoʻomalu maʻamau e hōʻemi i ka hiki ke hoʻopōʻino.E loaʻa i nā lumi i hoʻokaʻawale ʻia, a i ʻole ma ka liʻiliʻi loa o nā wahi kaʻawale kino, no: ka hoʻomākaukau mastermix, ka ʻili ʻana o ka waikawa nucleic a me ka hoʻohui ʻana i ka template DNA, ka hoʻonui ʻana a me ka lawelawe ʻana i nā huahana i hoʻonui ʻia, a me ka nānā ʻana i nā huahana, e laʻa me ka electrophoresis gel.

I kekahi mau hoʻonohonoho, paʻakikī ka loaʻa ʻana o 4 lumi kaʻawale.ʻO kahi koho kūpono akā ʻaʻole makemake nui ʻia ʻo ia ka hana ʻana i ka hoʻomākaukau mastermix ma kahi wahi hoʻopaʻa ʻia, e laʻa me ke keʻena hoʻoheheʻe laminar.I ka hihia o ka hoʻonui ʻana i ka PCR nested, pono e hoʻomākaukau ʻia ka hoʻomākaukau ʻana o ka mastermix no ka hopena o ka pōʻai ʻelua ma ka wahi 'maʻemaʻe' no ka hoʻomākaukau mastermix, akā pono e hana ʻia ka inoculation me ka huahana PCR mua ma ka lumi hoʻonui, a inā hiki. i loko o kahi wahi hoʻopaʻa i hoʻolaʻa ʻia (e laʻa me ke keʻena hoʻoheheʻe laminar).

Pono kēlā me kēia lumi / wahi i kahi ʻokoʻa o nā pipette i hoʻopaʻa inoa ʻia, nā ʻōlelo kānana, nā pahu paipu, nā vortex, centrifuges (inā pili), peni, generic lab reagents, nā lole lab a me nā pahu mīkina lima e waiho ʻia ma ko lākou mau keʻena hana.Pono e holoi ʻia nā lima a hoʻololi ʻia nā mīkina lima a me nā ʻaʻahu lab ke neʻe i waena o nā wahi i koho ʻia.ʻAʻole pono e hoʻoneʻe ʻia nā reagents a me nā mea hana mai kahi lepo lepo i kahi maʻemaʻe.Inā kū mai kahi hihia koʻikoʻi kahi e hoʻoneʻe ʻia ai kahi reagent a i ʻole ʻāpana mea hana i hope, pono e hoʻomaʻemaʻe mua ʻia me ka 10% sodium hypochlorite, a laila holoi ʻia me ka wai maʻemaʻe.

Nānā

Pono e hana hou ʻia ka 10% sodium hypochlorite solution i kēlā me kēia lā.Ke hoʻohana ʻia no ka decontamination, pono e hoʻopili ʻia ka manawa pili liʻiliʻi o 10 mau minuke.
ʻO kahi ʻē aʻe, hiki ke hoʻohana ʻia nā huahana i kūʻai ʻia i hoʻopaʻa ʻia ma ke ʻano he mea hoʻokaʻawale i ka ili e luku ana i ka DNA inā ʻaʻole ʻae nā ʻōlelo aʻoaʻo palekana kūloko i ka hoʻohana ʻana i ka sodium hypochlorite a inā ʻaʻole kūpono ka sodium hypochlorite no ka hoʻopau ʻana i nā ʻāpana metala o nā mea hana.

ʻO ke kūpono, pono nā limahana e mālama i ke ʻano o ka holo ʻana o ka hana unidirectional a ʻaʻole e hele mai nā wahi lepo (post-PCR) i nā wahi maʻemaʻe (pre-PCR) i ka lā hoʻokahi.Eia nō naʻe, aia kekahi mau manawa i hiki ʻole ke pale ʻia kēia.I ka wā e kū mai ai kēlā hanana, pono nā limahana e mālama pono e holoi lima, e hoʻololi i nā mīkina lima, e hoʻohana i ka lole lab i koho ʻia a ʻaʻole e hoʻokomo i nā mea hana a lākou e makemake ai e lawe hou i waho o ka lumi, e like me nā puke lab.Pono e hoʻoikaika ʻia ia ʻano hoʻomalu i ka hoʻomaʻamaʻa ʻana i nā limahana ma nā ʻano molecular.

Ma hope o ka hoʻohana ʻana, pono e hoʻomaʻemaʻe ʻia nā wahi noho me ka 10% sodium hypochlorite (a ukali ʻia e ka wai sterile e wehe ai i ke koena bleach), 70% ethanol, a i ʻole kahi mea kūʻai aku i hoʻopaʻa ʻia i ke kūʻai ʻana i ka mea hoʻopau DNA-decontaminant.ʻO ke kūpono, pono e hoʻokomo ʻia nā kukui ultra-violet (UV) e hiki ai ke hoʻokaʻawale ʻia e ka hoʻomālamalama.Eia nō naʻe, pono e kaupalena ʻia ka hoʻohana ʻana i nā kukui UV i nā wahi hana i pani ʻia, e laʻa i nā keʻena palekana, i mea e kaupalena ʻia ai ka ʻike ʻana o ka UV o nā limahana.E ʻoluʻolu e mālama i nā ʻōlelo aʻoaʻo o ka mea hana no ka mālama ʻana i nā kukui UV, ka ea a me ka hoʻomaʻemaʻe ʻana i mea e mālama pono ai nā kukui.

Inā hoʻohana ʻo 70% ethanol ma kahi o ka sodium hypochlorite, pono ka hoʻomālamalama ʻana me ke kukui UV e hoʻopau i ka decontamination.
Mai hoʻomaʻemaʻe i ka vortex a me ka centrifuge me ka sodium hypochlorite;akā, holoi i lalo me 70% ethanol a hōʻike i ke kukui UV, a i ʻole e hoʻohana i kahi mea hoʻopau hoʻopau DNA kalepa.No nā ʻōpala, e nānā me ka mea hana no ka ʻōlelo hoʻomaʻemaʻe hou aku.Inā ʻae nā ʻōlelo a ka mea hana, pono e hoʻomaʻemaʻe mau ʻia nā pipette me ka autoclave.Inā ʻaʻole hiki ke hoʻokuʻu ʻia nā pipettes, pono e hoʻomaʻemaʻe iā lākou me 10% sodium hypochlorite (a ukali ʻia e kahi holoi ʻana me ka wai sterile) a i ʻole me kahi mea hoʻopau hoʻopau DNA kālepa i ukali ʻia e ka ʻike UV.

ʻO ka hoʻomaʻemaʻe me ka pākēneka kiʻekiʻe o ka sodium hypochlorite hiki ke hōʻino i nā pipette plastic a me nā metala ke hana mau ʻia;e nānā mua i nā ʻōlelo paipai mai ka mea hana.Pono nā mea hana a pau e calibrated mau e like me ka papa hana i ʻōlelo ʻia.Pono ka mea i koho ʻia e mālama i ka hoʻopaʻa ʻana i ka papa kuhikuhi calibration, mālama ʻia nā lāʻau kikoʻī, a hōʻike maopopo ʻia nā lepili lawelawe ma nā mea hana.

3. Hoʻohana a hoʻomaʻemaʻe i ka ʻōlelo aʻoaʻo no ka wahi molekala i koho ʻia

Pre-PCR: Reagent aliquoting / mastermix hoʻomākaukau: ʻO kēia ka mea maʻemaʻe loa o nā wahi āpau i hoʻohana ʻia no ka hoʻomākaukau ʻana i nā hoʻokolohua molekala a ʻoi aku ka maikaʻi o kahi keʻena kahe laminar i hoʻolako ʻia me ke kukui UV.ʻAʻole pono e mālama ʻia nā laʻana, ka nucleic acid a me nā huahana PCR i hoʻonui ʻia ma kēia wahi.Pono e mālama ʻia nā mea hoʻonui hoʻonui i loko o ka pahu hau (a i ʻole ka pahu hau, e like me nā ʻōlelo aʻoaʻo o ka mea hana) ma kahi i koho ʻia, ma kahi kokoke i ke keʻena hoʻoheheʻe laminar a i ʻole kahi pre-PCR.Pono e hoʻololi ʻia nā mīkina lima i kēlā me kēia manawa ma ke komo ʻana i ka wahi ma mua o ka PCR a i ʻole ke keʻena hoʻoheheʻe laminar.

Pono e hoʻomaʻemaʻe ʻia ka wahi ma mua o ka PCR a i ʻole ke keʻena hoʻoheheʻe laminar ma mua a ma hope o ka hoʻohana ʻana penei: Holoi i lalo i nā mea āpau i loko o ke keʻena, e laʻa me nā pipettes, nā pahu kihi, vortex, centrifuge, nā paipu, peni, etc. me 70% ethanol a i ʻole a pāʻoihana DNA-hoʻopau decontaminant, a ae e maloʻo.I ka hihia o kahi wahi hana i pani ʻia, e laʻa me kahi keʻena hoʻoheheʻe laminar, e wehe i ka puʻu i ke kukui UV no 30 mau minuke.

Nānā

Mai hōʻike i nā reagents i ke kukui UV;e hoʻoneʻe wale iā lākou i loko o ke keʻena keʻena ke maʻemaʻe.Inā hoʻokō ʻia ka PCR transcription hoʻohuli, hiki ke kōkua i ka holoi ʻana i nā ʻili a me nā mea hana me kahi hopena e wāwahi ai i nā RNases ma ka hoʻopili ʻana.Hiki ke kōkua i ka pale ʻana i nā hopena maikaʻi ʻole mai ka hoʻohaʻahaʻa ʻana i ka enzyme o RNA.Ma hope o ka decontamination a ma mua o ka hoʻomākaukau ʻana i ka mastermix, pono e hoʻololi hou ʻia nā mīkina lima, a laila mākaukau ke kuhina e hoʻohana.

Pre-PCR: Wehe ʻakika nucleic / hoʻohui ʻia:

Pono e unuhi ʻia ka waika nucleic a mālama ʻia ma kahi lua i koho ʻia, me ka hoʻohana ʻana i kahi ʻāpana o nā pipettes, nā ʻōkuhi kānana, nā pahu pahu, nā mīkina lima hou, nā lole lab a me nā mea hana ʻē aʻe. nā paipu mastermix a i ʻole nā ​​papa.I mea e pale aku ai i ka hoʻohaumia ʻana o nā mea hoʻohālike nucleic acid i kālai ʻia, pono e hoʻololi i nā mīkina lima ma mua o ka lawelawe ʻana i nā mana maikaʻi a i ʻole nā ​​​​maʻamau a e hoʻohana i nā paipu ʻokoʻa.ʻAʻole pono e paipu ʻia nā PCR reagents a me nā huahana i hoʻonui ʻia ma kēia wahi.Pono e mālama ʻia nā laʻana i loko o nā pahu hau i koho ʻia a i ʻole nā ​​pahu hau ma kahi hoʻokahi.Pono e hoʻomaʻemaʻe ʻia ka laʻana wahi hana e like me ka mastermix space.

Post-PCR: Hoʻonui a lawelawe ʻana i ka huahana i hoʻonui ʻia

ʻO kēia wahi i koho ʻia no nā kaʻina hana post-amplification a pono e hoʻokaʻawale kino ʻia mai nā wahi pre-PCR.Loaʻa maʻamau i nā thermocyclers a me nā paepae manawa maoli, a he pono ke loaʻa i kahi keʻena kahe laminar no ka hoʻohui ʻana i ka huahana PCR puni 1 i ka hopena pōʻai 2, inā hana ʻia ka PCR pūnana.ʻAʻole pono e mālama ʻia nā reagents PCR a me ka waika nucleic i unuhi ʻia ma kēia wahi no ka mea he kiʻekiʻe ka pilikia o ka haumia.Pono e loaʻa i kēia wahi kahi pūlima ʻokoʻa o nā mīkina lima, nā ʻaʻahu keʻena, nā pā a me nā pahu paipu, nā pipette, nā ʻōlelo kānana, nā pahu a me nā mea hana ʻē aʻe.Pono e centrifuged nā paipu ma mua o ka wehe ʻana.Pono e hoʻomaʻemaʻe ʻia ka laʻana wahi hana e like me ka mastermix space.

Ma hope o ka PCR: Nānā huahana

ʻO kēia keʻena no nā lako ʻike huahana, e laʻa me nā pahu electrophoresis gel, nā pahu mana, UV transilluminator a me ka ʻōnaehana palapala gel.Pono e loaʻa i kēia wahi nā pūlima kaʻawale, nā ʻaʻahu keʻena, nā pā a me nā pahu paipu, nā pipette, nā ʻōkuhi kānana, nā pahu a me nā mea hana ʻē aʻe.ʻAʻole hiki ke lawe ʻia i loko o kēia wahi nā reagents ʻē aʻe, me ka waiho ʻole ʻana i ka waihoʻoluʻu hoʻouka ʻana, ka marker molecular a me ka gel agarose, a me nā mea pale.Pono e hoʻomaʻemaʻe ʻia ka laʻana wahi hana e like me ka mastermix space.

Palapala nui

ʻO ke kūpono, ʻaʻole pono e hoʻokomo ʻia nā lumi pre-PCR i ka lā hoʻokahi inā ua hana mua ʻia ka hana ma nā lumi post-PCR.Inā ʻaʻole hiki ke pale ʻia kēia, e hōʻoia i ka holoi mua ʻia ʻana o nā lima a hoʻokomo ʻia nā ʻaʻahu lab kikoʻī i loko o nā lumi.ʻAʻole pono e lawe ʻia nā puke Lab a me nā pepa i loko o nā lumi pre-PCR inā ua hoʻohana ʻia i loko o nā lumi post-PCR;inā pono, e lawe i nā paʻi kope o nā protocols/ sample IDs, etc.

4. Nā ʻōlelo aʻoaʻo biology molecular maʻamau

E hoʻohana i nā mīkina lima pauka ʻole e pale i ka hoʻāʻo ʻana.ʻO ka ʻenehana paipu kūpono ka mea nui i ka hōʻemi ʻana i ka haumia.Hiki i ka paipu hewa ʻole ke hopena i ka paʻi ʻana i ka wai a me ka hana ʻana i nā aerosol.Hiki ke loa'a ka ho'oma'ama'a maika'i no ka paipu pololei ma nā loulou ma lalo iho nei: Ke alaka'i 'o Gilson i ka paipu 'ana, nā wikiō 'enehana pipetting Anachem, nā paipu Centrifuge ma mua o ka wehe 'ana, a wehe pono i mea e pale aku ai i ka pa'i.E pani koke i nā paipu ma hope o ka hoʻohana ʻana e pale i ka hoʻokomo ʻia ʻana o nā mea haumia.

I ka hana ʻana i nā ʻano like ʻole, e hoʻomākaukau i hoʻokahi mastermix i loaʻa nā reagents maʻamau (e laʻa i ka wai, dNTPs, buffer, primers a me ka enzyme) e hōʻemi i ka nui o nā hoʻololi reagent a e hōʻemi i ka hoʻoweliweli o ka haumia.Manaʻo ʻia e hoʻonohonoho i ka mastermix ma luna o ka hau a i ʻole kahi poloka anu.Hiki ke kōkua ka hoʻohana ʻana i kahi enzyme Hot Start e hōʻemi i ka hana ʻana o nā huahana kikoʻī ʻole.E pale i nā reagents i loaʻa nā ʻimi fluorescent mai ka mālamalama i mea e pale aku ai i ka hōʻino.

5. Nā mana o loko

E hoʻokomo i nā mana maikaʻi i hōʻoia ʻia, i hoʻopaʻa ʻia a maikaʻi ʻole, me ka mana no-template i nā hopena a pau, a me kahi trendline titrated multi-point no nā hopena quantitative.ʻAʻole pono e ikaika loa ka mana maikaʻi e hoʻopilikia ai i ka hoʻopōʻino.E hoʻokomo i nā mana hoʻoheheʻe maikaʻi a maikaʻi ʻole i ka wā e hana ana i ka unuhi ʻana i ka nucleic acid.

Manaʻo ʻia e kau ʻia nā ʻōlelo kuhikuhi ma kēlā me kēia wahi i ʻike nā mea hoʻohana i nā lula o ka hana.Makemake paha nā labs diagnostic e ʻike ana i nā pae haʻahaʻa loa o DNA a i ʻole RNA i loko o nā laʻana lapaʻau e hoʻohana i ke ana palekana hou aʻe o ka loaʻa ʻana o nā ʻōnaehana lawelawe ʻana i ka ea me ke kaomi ea maikaʻi iki i nā lumi pre-PCR a me ke kaomi ea maikaʻi ʻole i nā keʻena post-PCR.

ʻO ka mea hope loa, kōkua ka hoʻomohala ʻana i kahi hoʻolālā hōʻoia maikaʻi (QA).Pono e komo i loko o ia hoʻolālā nā papa inoa o nā kumu waiwai reagent a me nā mea hana, nā lula no ka mālama ʻana i nā kits a me nā reagents, ka hōʻike ʻana i nā hopena hoʻomalu, nā papahana hoʻomaʻamaʻa limahana, nā algorithms hoʻoponopono pilikia, a me nā hana hoʻoponopono inā pono.

6. Palapala Palapala

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Mokuna 3: Hoʻonohonoho i kahi hale hana qPCR.He palapala alakaʻi no ka hoʻāʻo ʻana i nā wai leʻaleʻa me ka hoʻohana ʻana i ke ʻano USEPA qPCR 1611. Lansing- Michigan State University.

Ke Ola Ola ʻEnelani, NHS.Nā kūlana UK no ka noiʻi ʻana i ka microbiology: Good Laboratory Practice i ka wā e hana ana i nā ʻike hoʻonui molecular).Ke alakaʻi maikaʻi.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Hoʻonohonoho i kahi keʻena PCR.Pūnaʻi Anuanu Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Ka mālama maʻamau o nā centrifuges: hoʻomaʻemaʻe, mālama a me ka disinfection o nā centrifuges, rotors a me nā mea hoʻololi (White pepa No. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Maikaʻi Clinical Laboratory Practice (GCLP) no nā hoʻokolohua molecular based i hoʻohana ʻia i nā keʻena diagnostic, In: Akyar I, hoʻoponopono.ʻAno ākea o ka mana maikaʻi.Rijeka, Kroasia: Intech;2011: 29–52.