Os métodos de detección molecular teñen a capacidade de producir un gran volume de ácido nucleico mediante a amplificación de cantidades traza atopadas nas mostras.Aínda que isto é beneficioso para permitir a detección sensible, tamén introduce a posibilidade de contaminación mediante a propagación de aerosois de amplificación no entorno do laboratorio.Ao realizar experimentos pódense tomar medidas para evitar a contaminación dos reactivos, do equipamento de laboratorio e do espazo de banco, xa que tal contaminación pode xerar resultados falsos positivos (ou falsos negativos).

Para axudar a reducir a probabilidade de contaminación, débense practicar en todo momento as Boas Prácticas de Laboratorio.En concreto, deben tomarse precaucións nos seguintes puntos:

1. Manexo de reactivos
2. Organización do espazo de traballo e dos equipamentos
3. Consellos de uso e limpeza para o espazo molecular designado
4. Asesoramento xeral de bioloxía molecular
5. Controis internos
6. Bibliografía

1. Manexo de reactivos

Centrifugar brevemente os tubos de reactivos antes de abrilos para evitar a xeración de aerosois.Reactivos alícuotas para evitar múltiples conxelacións e desconxelacións e a contaminación das cepas principais.Etiquete e data claramente todos os reactivos e tubos de reacción e manteña rexistros dos números de lote e lotes de reactivos utilizados en todos os experimentos.Pipetear todos os reactivos e mostras usando puntas de filtro.Antes da compra, é recomendable confirmar co fabricante que as puntas do filtro se axustan á marca de pipeta que se vai utilizar.

2. Organización do espazo de traballo e dos equipamentos

O espazo de traballo debe organizarse para garantir que o fluxo de traballo se produza nunha dirección, desde áreas limpas (pre-PCR) ata áreas sucias (post-PCR).As seguintes precaucións xerais axudarán a reducir a posibilidade de contaminación.Dispoñer de salas separadas, ou como mínimo de áreas físicamente separadas, para: preparación da mestura principal, extracción de ácidos nucleicos e adición de moldes de ADN, amplificación e manipulación do produto amplificado e análise do produto, por exemplo, electroforese en xel.

Nalgúns escenarios, é difícil ter 4 salas separadas.Unha opción posible, pero menos desexable, é facer a preparación da mestura principal nunha zona de contención, por exemplo, un armario de fluxo laminar.No caso da amplificación por PCR aniñada, a preparación da mestura mestra para a reacción da segunda rolda debe prepararse na zona "limpa" para a preparación da mestura principal, pero a inoculación co produto primario da PCR debe facerse na sala de amplificación, e se é posible. nunha zona de contención dedicada (por exemplo, un armario de fluxo laminar).

Cada sala/zona necesita un conxunto separado de pipetas, puntas de filtro, bastidores de tubos, vórtices, centrífugas (se é o caso), bolígrafos, reactivos xenéricos de laboratorio, batas de laboratorio e caixas de luvas claramente etiquetados que permanecerán nos seus respectivos postos de traballo.Deberán lavarse as mans e cambiarse as luvas e as batas de laboratorio cando se desprazan entre as áreas designadas.Os reactivos e os equipos non deben moverse dunha zona sucia a unha limpa.No caso de que se produza un caso extremo no que un reactivo ou un equipamento teña que ser movido cara atrás, primeiro debe descontaminarse con hipoclorito sódico ao 10 %, seguido dun limpo con auga estéril.

Nota

A solución de hipoclorito sódico ao 10% debe prepararse fresca diariamente.Cando se utiliza para a descontaminación, débese respectar un tempo de contacto mínimo de 10 minutos.
Alternativamente, pódense utilizar produtos dispoñibles comercialmente validados como descontaminantes de superficie que destruen o ADN se as recomendacións locais de seguridade non permiten o uso de hipoclorito de sodio ou se o hipoclorito de sodio non é adecuado para descontaminar as partes metálicas dos equipos.

O ideal é que o persoal cumpra a ética do fluxo de traballo unidireccional e non pase de áreas sucias (post-PCR) a áreas limpas (pre-PCR) o mesmo día.Non obstante, pode haber ocasións nas que isto sexa inevitable.Cando se produza, o persoal debe ter coidado de lavarse ben as mans, cambiarse as luvas, usar a bata de laboratorio designada e non introducir ningún material que queira sacar da sala de novo, como libros de laboratorio.Tales medidas de control deberían facerse fincapé na formación do persoal sobre métodos moleculares.

Despois do uso, os espazos da bancada deben limparse con hipoclorito de sodio ao 10 % (seguido de auga estéril para eliminar a lixivia residual), etanol ao 70 % ou un descontaminante destrutor de ADN dispoñible no comercio.Idealmente, deberían instalarse lámpadas ultravioleta (UV) para permitir a descontaminación por irradiación.Non obstante, o uso de lámpadas UV debe restrinxirse a zonas de traballo pechadas, por exemplo, armarios de seguridade, para limitar a exposición aos UV do persoal do laboratorio.Siga as instrucións do fabricante para o coidado, ventilación e limpeza da lámpada UV para garantir que as lámpadas sigan sendo eficaces.

Se se usa etanol ao 70% en lugar de hipoclorito de sodio, será necesaria a irradiación con luz UV para completar a descontaminación.
Non limpar o vórtice e centrifugar con hipoclorito de sodio;en vez diso, limpe con etanol ao 70% e expóñase á luz UV, ou use un descontaminante comercial que destrúa o ADN.En caso de verteduras, consulte co fabricante para obter máis consellos de limpeza.Se as instrucións do fabricante o permiten, as pipetas deben esterilizarse habitualmente en autoclave.Se as pipetas non se poden esterilizar en autoclave, abondará con limpalas con hipoclorito de sodio ao 10% (seguido dun limpo completo con auga estéril) ou cun descontaminante comercial que destrúe o ADN seguido de exposición a UV.

A limpeza con hipoclorito de sodio de alta porcentaxe pode eventualmente danar os plásticos e metais da pipeta se se fai de forma regular;Comprobe primeiro as recomendacións do fabricante.Todos os equipos deben ser calibrados regularmente segundo o calendario recomendado polo fabricante.Unha persoa designada debe ser a encargada de garantir que se cumpra o calendario de calibración, que se manteñan rexistros detallados e que as etiquetas de servizo se exhiban claramente no equipo.

3. Consellos de uso e limpeza para o espazo molecular designado

Pre-PCR: alícuotación de reactivos/preparación da mestura maxistral: este debe ser o espazo máis limpo de todos os utilizados para a preparación de experimentos moleculares e, idealmente, debe ser un armario de fluxo laminar designado equipado cunha luz UV.As mostras, o ácido nucleico extraído e os produtos de PCR amplificados non deben manipularse nesta zona.Os reactivos de amplificación deben manterse nun conxelador (ou frigorífico, segundo as recomendacións do fabricante) no mesmo espazo designado, idealmente xunto ao armario de fluxo laminar ou á área de pre-PCR.As luvas deben cambiarse cada vez ao entrar na área de pre-PCR ou no armario de fluxo laminar.

A área de pre-PCR ou o gabinete de fluxo laminar debe limparse antes e despois do uso do seguinte xeito: Limpe todos os elementos do gabinete, por exemplo pipetas, caixas de puntas, vórtice, centrífuga, bastidores de tubos, bolígrafos, etc. con etanol ao 70 % ou un descontaminante comercial que destrúe o ADN e deixe secar.No caso dunha zona de traballo pechada, por exemplo, un armario de fluxo laminar, expoña a campá á luz UV durante 30 minutos.

Nota

Non expoña os reactivos á luz UV;só movelos ao armario unha vez que estea limpo.Se se realiza a PCR de transcrición inversa, tamén pode ser útil limpar as superficies e os equipos cunha solución que descomponga as RNases ao contacto.Isto pode axudar a evitar resultados falsos negativos da degradación enzimática do ARN.Despois da descontaminación e antes de preparar a mestura principal, as luvas deben cambiarse unha vez máis e, a continuación, o armario está listo para usar.

Pre-PCR: extracción de ácidos nucleicos/adición de modelos:

O ácido nucleico debe extraerse e manipularse nunha segunda área designada, utilizando un conxunto separado de pipetas, puntas de filtro, soportes para tubos, luvas frescas, batas de laboratorio e outros equipos. Esta área tamén serve para engadir modelos, controis e liñas de tendencia ao tubos ou placas mastermix.Para evitar a contaminación das mostras de ácido nucleico extraídas que se están a analizar, recoméndase cambiar as luvas antes de manipular controis positivos ou patróns e utilizar un conxunto de pipetas separado.Os reactivos de PCR e os produtos amplificados non deben pipetearse nesta zona.As mostras deben almacenarse en frigoríficos ou conxeladores designados na mesma zona.O espazo de traballo de mostra debe ser limpo do mesmo xeito que o espazo mastermix.

Post-PCR: Amplificación e manexo do produto amplificado

Este espazo designado é para procesos posteriores á amplificación e debe estar físicamente separado das áreas previas á PCR.Normalmente contén termocicladores e plataformas en tempo real, e idealmente debería ter un armario de fluxo laminar para engadir o produto de PCR da rolda 1 á reacción da rolda 2, se se está a realizar a PCR aniñada.Os reactivos de PCR e o ácido nucleico extraído non deben manipularse nesta zona xa que o risco de contaminación é elevado.Esta zona debe ter un conxunto separado de luvas, batas de laboratorio, bastidores de placas e tubos, pipetas, puntas de filtro, colectores e outros equipos.Os tubos deben ser centrifugados antes de abrir.O espazo de traballo de mostra debe ser limpo do mesmo xeito que o espazo mastermix.

Post-PCR: análise de produto

Esta sala é para equipos de detección de produtos, por exemplo, tanques de electroforese en xel, paquetes de enerxía, transiluminador UV e sistema de documentación de xel.Esta área debe ter xogos separados de luvas, batas de laboratorio, bastidores de placas e tubos, pipetas, puntas de filtro, colectores e outros equipos.Non se poden introducir outros reactivos nesta zona, excepto o colorante de carga, o marcador molecular e o xel de agarosa e os compoñentes tampón.O espazo de traballo de mostra debe ser limpo do mesmo xeito que o espazo mastermix.

Nota importante

O ideal é que as salas pre-PCR non se poidan entrar o mesmo día se xa se traballou nas salas post-PCR.Se isto é completamente inevitable, asegúrese de que primeiro se lave ben as mans e de que se levan batas de laboratorio específicas nas salas.Os libros de laboratorio e os trámites non deben levarse ás salas previas á PCR se se utilizaron nas salas posteriores á PCR;se é necesario, tome copias impresas dos protocolos/ID de mostras, etc.

4. Asesoramento xeral de bioloxía molecular

Use luvas sen po para evitar a inhibición do ensaio.A técnica de pipeteo correcta é fundamental para reducir a contaminación.Un pipeteo incorrecto pode provocar salpicaduras ao dispensar líquidos e a creación de aerosois.As boas prácticas para o pipeteo correcto pódense atopar nas seguintes ligazóns: Guía Gilson para pipetear, Vídeos da técnica de pipeteo Anachem, Tubos de centrífuga antes de abrilos e ábreos con coidado para evitar salpicaduras.Pechar os tubos inmediatamente despois do uso para evitar a introdución de contaminantes.

Ao realizar varias reaccións, prepare unha mestura principal que conteña reactivos comúns (por exemplo, auga, dNTP, tampón, cebadores e encima) para minimizar o número de transferencias de reactivos e reducir a ameaza de contaminación.Recoméndase configurar a mastermix sobre xeo ou un bloque frío.O uso dunha enzima Hot Start pode axudar a reducir a produción de produtos non específicos.Protexa da luz os reactivos que conteñan sondas fluorescentes para evitar a súa degradación.

5. Controis internos

Inclúe controis positivos e negativos confirmados e ben caracterizados, xunto cun control sen modelo en todas as reaccións e unha liña de tendencia titulada en varios puntos para as reaccións cuantitativas.O control positivo non debe ser tan forte que supoña un risco de contaminación.Incluír controis de extracción positivos e negativos ao realizar a extracción de ácidos nucleicos.

Recoméndase que en cada unha das áreas se publiquen instrucións claras para que os usuarios coñezan as normas de conduta.Os laboratorios de diagnóstico que detectan niveis moi baixos de ADN ou ARN en mostras clínicas poden querer adoptar a medida de seguridade adicional de ter sistemas separados de tratamento de aire con presión de aire lixeiramente positiva nas salas previas á PCR e unha presión de aire lixeiramente negativa nas salas posteriores á PCR.

Por último, é útil desenvolver un plan de garantía de calidade (QA).Tal plan debería incluír listas de stocks principais de reactivos e stocks de traballo, regras para almacenar kits e reactivos, informes de resultados de control, programas de formación do persoal, algoritmos de resolución de problemas e accións correctoras cando sexa necesario.

6. Bibliografía

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Capítulo 3: Configurar un laboratorio de qPCR.Un documento de orientación para probar augas recreativas usando o método qPCR da USEPA 1611. Lansing- Michigan State University.

Saúde Pública Inglaterra, NHS.Estándares do Reino Unido para investigacións de microbioloxía: boas prácticas de laboratorio cando se realizan ensaios de amplificación molecular).Orientación de calidade.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Configurando un laboratorio de PCR.Protoc de Cold Spring Harb.2007; 7.

Schroeder S 2013. Mantemento rutineiro de centrífugas: limpeza, mantemento e desinfección de centrífugas, rotores e adaptadores (Libro Branco no 14).Hamburgo: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Boas prácticas de laboratorio clínico (GCLP) para probas de base molecular utilizadas en laboratorios de diagnóstico, En: Akyar I, editor.Amplo espectro de control de calidade.Rijeka, Croacia: Intech;2011: 29–52.