Tha comas aig dòighean lorgaidh moileciuil àireamh mhòr de dh’ searbhag niuclasach a thoirt gu buil tro bhith ag àrdachadh meud lorg a lorgar ann an sampallan.Ged a tha seo buannachdail airson lorg mothachail a chomasachadh, tha e cuideachd a’ toirt a-steach comas truailleadh tro bhith a’ sgaoileadh aerosolas leudachaidh ann an àrainneachd obair-lann.Nuair a bhios tu a’ dèanamh dheuchainnean, faodar ceumannan a ghabhail gus truailleadh ath-bheachdan, uidheamachd obair-lann agus àite beinne a sheachnadh, leis gum faodadh an truailleadh sin toraidhean meallta-dearbhach (no meallta-àicheil) a ghineadh.

Gus cuideachadh le bhith a' lùghdachadh coltas truailleadh, bu chòir Deagh Chleachdadh Obair-lann a chleachdadh fad na h-ùine.Gu sònraichte, bu chòir a bhith faiceallach mu na puingean a leanas:

1. A 'làimhseachadh ath-bheachdan
2. Eagrachadh àite-obrach agus uidheam
3. Cleachdadh agus comhairle glanaidh airson an àite molecular ainmichte
4. Comhairle coitcheann bith-eòlas moileciuil
5. Smachdan a-staigh
6. Leabhar-chlàr

1. A 'làimhseachadh ath-bheachdan

Goirid centrifuge reagent tubes mus fosgladh a sheachnadh gineadh aerosols.Aliquot ath-bheachdan gus iomadh reothadh-leaghadh agus truailleadh prìomh stoc a sheachnadh.Dèan gu soilleir leubail agus cuir ceann-latha air a h-uile pìob ath-ghnìomhach agus ath-bhualadh agus cùm suas logaichean de chrann reagent agus àireamhan baidse a chaidh a chleachdadh anns a h-uile deuchainn.Pìob gach ath-bheachdan agus sampaill a’ cleachdadh molaidhean sìoltachain.Mus tèid a cheannach, tha e ciallach dearbhadh leis an neach-dèanamh gu bheil na molaidhean sìoltachain a’ freagairt air a’ bhrannd pìobaireachd a thèid a chleachdadh.

2. Eagrachadh àite-obrach agus uidheam

Bu chòir àite-obrach a chuir air dòigh gus dèanamh cinnteach gu bheil an sruth obrach a’ tachairt ann an aon taobh, bho raointean glan (ro-PCR) gu raointean salach (an dèidh PCR).Cuidichidh na ceumannan coitcheann a leanas gus an cunnart bho thruailleadh a lùghdachadh.Biodh seòmraichean ainmichte fa leth agad, no co-dhiù raointean fa leth gu corporra, airson: ullachadh mastermix, às-tharraing searbhag niuclasach agus cur-ris teamplaid DNA, leudachadh agus làimhseachadh toradh meudaichte, agus mion-sgrùdadh toraidh, me electrophoresis gel.

Ann an cuid de shuidheachaidhean, tha e duilich 4 seòmraichean fa leth a bhith agad.Is e roghainn a dh’ fhaodadh a bhith ann ach nach eil cho ion-mhiannaichte ullachadh mastermix a dhèanamh ann an raon dìon, me caibineat sruthadh laminar.Ann an cùis leudachadh PCR neadachaidh, bu chòir ullachadh an mastermix airson an dàrna freagairt cruinn a bhith air ullachadh anns an raon ‘glan’ airson ullachadh mastermix, ach bu chòir an inoculation leis a ’phrìomh thoradh PCR a dhèanamh anns an t-seòmar leudachaidh, agus ma ghabhas sin dèanamh. ann an raon dìon sònraichte (me caibineat sruthadh laminar).

Feumaidh gach seòmar/raon seata air leth de phìoban le bileagan soilleir, molaidhean sìoltachain, racaichean tiùba, vortexes, centrifuges (ma tha sin iomchaidh), pinn, ath-bheachdan obair-lann gnèitheach, còtaichean obair-lann agus bogsaichean mhiotagan a dh’fhuiricheas aig na h-ionadan-obrach aca.Feumar làmhan a nighe agus miotagan agus còtaichean obair-lann atharrachadh nuair a ghluaiseas iad eadar na raointean ainmichte.Cha bu chòir ath-bheachdan agus uidheamachd a ghluasad bho àite salach gu àite glan.Ma dh’ èiricheas fìor chùis far am feumar inneal no inneal a ghluasad air ais, feumar an-toiseach a bhith air a thruailleadh le sodium hypochlorite 10%, agus an uairsin a sguabadh sìos le uisge teann.

Thoir an aire

Feumaidh am fuasgladh sodium hypochlorite 10% a bhith air a dhèanamh suas ùr gach latha.Nuair a thèid a chleachdadh airson dì-thruailleadh, bu chòir cumail ris an ùine conaltraidh as lugha de 10 mionaidean.
Air an làimh eile, faodar toraidhean a tha rim faighinn gu malairteach a tha air an dearbhadh mar stuthan truailleadh uachdar sgrios DNA a chleachdadh mura h-eil molaidhean sàbhailteachd ionadail a’ ceadachadh sodium hypochlorite a chleachdadh no mura h-eil sodium hypochlorite freagarrach airson a bhith a’ truailleadh na pàirtean meatailteach den uidheamachd.

Gu h-iomchaidh, bu chòir do luchd-obrach cumail ris an fheallsanachd sruth-obrach aon-stiùiridh agus gun a dhol bho raointean salach (post-PCR) air ais gu raointean glan (ro-PCR) air an aon latha.Ach, dh’ fhaodadh gum bi amannan ann nuair nach gabh seo a sheachnadh.Nuair a dh’ èiricheas an leithid de thachartas, feumaidh luchd-obrach a bhith faiceallach an làmhan a nighe gu mionaideach, miotagan atharrachadh, an còta obair-lann ainmichte a chleachdadh agus gun a bhith a’ toirt a-steach uidheamachd sam bith a bhios iad airson a thoirt a-mach às an t-seòmar a-rithist, leithid leabhraichean obair-lann.Bu chòir cuideam a chuir air ceumannan smachd leithid seo ann an trèanadh luchd-obrach air dòighean moileciuil.

Às deidh an cleachdadh, bu chòir beàrnan beinne a bhith air an glanadh le 10% sodium hypochlorite (air a leantainn le uisge sterile gus bleach a tha air fhàgail a thoirt air falbh), 70% ethanol, no inneal-sgrios dearbhte DNA-sgriosail.Gu h-iomchaidh, bu chòir lampaichean ultra-bhiolet (UV) a bhith air an uidheamachadh gus an tèid dì-thruailleadh le irradachadh.Ach, bu chòir cleachdadh lampaichean UV a bhith air a chuingealachadh ri raointean obrach dùinte, me caibineatan sàbhailteachd, gus casg a chuir air foillseachadh UV luchd-obrach an obair-lann.Feuch an cùm thu ri stiùireadh an neach-dèanamh airson cùram lampa UV, fionnarachadh agus glanadh gus dèanamh cinnteach gu bheil lampaichean fhathast èifeachdach.

Ma chleachdas tu 70% ethanol an àite sodium hypochlorite, bidh feum air irradachadh le solas UV gus an dì-thruailleadh a chrìochnachadh.
Na glan am vortex agus centrifuge le sodium hypochlorite;an àite sin, sguab sìos le 70% ethanol agus nochdaidh e do sholas UV, no cleachd inneal-sgudail malairteach DNA-sgrios.Airson dòrtadh, faigh sùil air an neach-dèanamh airson tuilleadh comhairle glanaidh.Ma cheadaicheas stiùireadh neach-dèanamh sin, bu chòir pìoban a bhith air an sterilachadh gu cunbhalach le autoclave.Mura h-urrainn pìobairean a bhith fèin-ghluasadach, bu chòir gum biodh e gu leòr an glanadh le 10% sodium hypochlorite (air a leantainn le sguabadh domhainn le uisge steril) no le inneal-sgudail malairteach DNA-sgrios agus an uairsin nochd UV.

Faodaidh glanadh le sodium hypochlorite àrd sa cheud milleadh a dhèanamh air plastaigean pìobaireachd agus meatailtean ma thèid a dhèanamh gu cunbhalach;thoir sùil air molaidhean bhon neach-dèanamh an toiseach.Feumar a h-uile uidheamachd a chalpachadh gu cunbhalach a rèir a’ chlàr-ama a thathar a’ moladh leis an neach-dèanamh.Bu chòir do neach ainmichte a bhith an urra ri dèanamh cinnteach gu bheilear a’ cumail ris a’ chlàr calibration, gu bheil logaichean mionaideach air an cumail, agus gu bheil bileagan seirbheis air an taisbeanadh gu soilleir air uidheamachd.

3. Cleachdadh agus comhairle glanaidh airson an àite molecular ainmichte

Ro-PCR: Reagent aliquoting / mastermix ullachadh: Bu chòir gur e seo an àite as glaine de na h-àiteachan gu lèir a thathas a’ cleachdadh airson ullachadh deuchainnean moileciuil agus bu chòir dha a bhith na chaibineat sruthadh laminar ainmichte le solas UV.Chan fhaodar sampaill, searbhag niuclasach a chaidh a thoirt a-mach agus toraidhean PCR meudaichte a làimhseachadh san raon seo.Bu chòir ath-bheachdan leudachaidh a chumail ann an reothadair (no fuaradair, a rèir molaidhean an neach-dèanamh) san aon àite ainmichte, gu h-iomchaidh ri taobh caibineat sruthadh laminar no àite ro-PCR.Bu chòir miotagan atharrachadh gach uair nuair a thèid thu a-steach don raon ro-PCR no caibineat sruthadh laminar.

Bu chòir an raon ro-PCR no caibineat sruthadh laminar a ghlanadh ro agus às deidh a chleachdadh mar a leanas: Sguab sìos a h-uile rud sa chaibineat, me pìoban, bogsaichean tip, vortex, centrifuge, racaichean tiùba, pinn, msaa le 70% ethanol no a. malairteach DNA-sgrios dì-thruailleadh, agus leigeil tiormachadh.Ma tha raon obrach dùinte, me caibineat sruthadh laminar, nochd a’ chochall gu solas UV airson 30 mionaid.

Thoir an aire

Na cuir a-steach ath-bheachdan gu solas UV;gluais iad a-steach don chaibineat a-mhàin aon uair 's gu bheil e glan.Ma tha thu a’ coileanadh PCR tar-sgrìobhaidh cùil, dh’ fhaodadh gum biodh e cuideachail cuideachd uachdar agus uidheamachd a sguabadh sìos le fuasgladh a bhriseas sìos RNase air conaltradh.Dh’ fhaodadh seo cuideachadh le bhith a’ seachnadh toraidhean meallta-àicheil bho bhith a’ lughdachadh enzyme RNA.Às deidh dì-thruailleadh agus mus ullaich thu am mastermix, bu chòir miotagan atharrachadh a-rithist, agus an uairsin bidh an caibineat deiseil airson a chleachdadh.

Ro-PCR: às-tharraing searbhag niuclasach / cur-ris teamplaid:

Feumar searbhag niuclasach a thoirt a-mach agus a làimhseachadh ann an dàrna àite ainmichte, a’ cleachdadh seata air leth de phìoban, molaidhean sìoltachain, racaichean tiùba, miotagan ùra, còtaichean obair-lann agus uidheamachd eile. pìoban no truinnsearan mastermix.Gus truailleadh de na sampallan searbhag niuclasach a thathas a’ sgrùdadh a sheachnadh, thathas a’ moladh miotagan atharrachadh mus tèid smachdan no inbhean adhartach a làimhseachadh agus seata de phìoban air leth a chleachdadh.Chan fhaod ath-bheachdan PCR agus toraidhean leudaichte a bhith air an pìobadh san raon seo.Bu chòir sampallan a stòradh ann am fridsichean no reothadairean ainmichte san aon àite.Bu chòir an àite-obrach sampall a ghlanadh san aon dòigh ris an àite mastermix.

Post-PCR: Meudachadh agus làimhseachadh an toraidh leudaichte

Tha an t-àite ainmichte seo airson pròiseasan iar-leudachadh agus bu chòir a bhith air a sgaradh gu corporra bho na raointean ro-PCR.Mar as trice bidh thermocyclers agus àrd-ùrlaran fìor-ùine ann, agus bu chòir gum biodh caibineat sruthadh laminar ann airson toradh cruinn 1 PCR a chuir ris an ath-bhualadh cuairt 2, ma thathas a’ coileanadh PCR neadachaidh.Chan fhaodar ath-bheachdan PCR agus searbhag niuclasach a chaidh a thoirt a-mach a làimhseachadh san raon seo leis gu bheil an cunnart truailleadh àrd.Bu chòir seata air leth de mhiotagan, còtaichean obair-lann a bhith aig an raon seo, racaichean truinnsear is tiùba, pìoban, molaidhean sìoltachain, bionaichean agus uidheamachd eile.Feumaidh pìoban a bhith air an centrifuged mus fosgladh iad.Bu chòir an àite-obrach sampall a ghlanadh san aon dòigh ris an àite mastermix.

Post-PCR: Mion-sgrùdadh toraidh

Tha an seòmar seo airson uidheamachd lorg toraidh, me tancaichean gel electrophoresis, pacaidean cumhachd, transilluminator UV agus an siostam sgrìobhainnean gel.Bu chòir seataichean fa leth de mhiotagan, còtaichean obair-lann a bhith san raon seo, racaichean truinnsear is tiùba, pìoban, molaidhean sìoltachain, bionaichean agus uidheamachd eile.Chan urrainnear ath-bheachdan sam bith eile a thoirt a-steach don raon seo, ach a-mhàin dath luchdaidh, comharradh moileciuil agus gel agarose, agus co-phàirtean bufair.Bu chòir an àite-obrach sampall a ghlanadh san aon dòigh ris an àite mastermix.

Nòta cudromach

Mas fheàrr, cha bu chòir na seòmraichean ro-PCR a dhol a-steach air an aon latha ma chaidh obair a dhèanamh mu thràth anns na seòmraichean post-PCR.Ma tha seo gu tur do-sheachanta, dèan cinnteach gu bheil làmhan air an nighe gu mionaideach an toiseach agus gu bheil còtaichean obair-lann sònraichte air an caitheamh anns na seòmraichean.Chan fhaodar leabhraichean lab agus pàipearan a thoirt a-steach do na seòmraichean ro-PCR ma chaidh an cleachdadh anns na seòmraichean post-PCR;ma tha sin riatanach, thoir a-mach clò-bhualaidhean dùblaichte de phròtacalan / IDan sampall, msaa.

4. Comhairle coitcheann bith-eòlas moileciuil

Cleachd miotagan gun phùdar gus casg a chuir air assay a sheachnadh.Tha dòigh pìobaireachd ceart air leth cudromach gus truailleadh a lughdachadh.Faodaidh pìobadh ceàrr a bhith mar thoradh air frasadh nuair a thathar a’ sgaoileadh lioftaichean agus a’ cruthachadh aerosolas.Gheibhear deagh chleachdadh airson pìobaireachd ceart aig na ceanglaichean a leanas: Stiùireadh Gilson air pìobaireachd, bhideothan innleachd pìobaireachd Anachem, tiùban Centrifuge mus fosgail iad, agus fosgail iad gu faiceallach gus nach frasadh iad.Dùin na tiùban dìreach às deidh an cleachdadh gus casg a chuir air truailleadh.

Nuair a bhios tu a’ dèanamh iomadh ath-bhualadh, ullaich aon phrìomh mheasgachadh anns a bheil ath-bheachdan cumanta (me uisge, dNTPs, bufair, primers agus enzyme) gus an àireamh de ghluasadan ath-bheachdan a lughdachadh agus an cunnart bho thruailleadh a lughdachadh.Thathas a 'moladh am mastermix a stèidheachadh air deigh no bloc fuar.Faodaidh cleachdadh enzyme Hot Start cuideachadh le bhith a’ lughdachadh cinneasachadh thoraidhean neo-shònraichte.Dìon ath-bheachdan anns a bheil probes flùraiseach bho sholas gus truailleadh a sheachnadh.

5. Smachdan a-staigh

Cuir a-steach smachdan dearbhach agus àicheil le deagh charactar, còmhla ri smachd gun teamplaid anns a h-uile freagairt, agus loidhne gluasad ioma-phuing airson ath-bheachdan cainneachdail.Cha bu chòir don smachd adhartach a bhith cho làidir is gu bheil e na chunnart truailleadh.Cuir a-steach smachdan às-tharraing dearbhach agus àicheil nuair a bhios tu a’ toirt a-mach searbhag niuclasach.

Thathas a’ moladh gun tèid stiùireadh soilleir a phostadh anns gach raon gus am bi luchd-cleachdaidh mothachail air riaghailtean giùlain.Is dòcha gum bi deuchainn-lannan dearbhaidh a tha a’ lorg ìrean glè ìosal de DNA no RNA ann an sampallan clionaigeach ag iarraidh gabhail ris a’ cheum tèarainteachd a bharrachd de bhith a’ faighinn siostaman làimhseachaidh adhair fa-leth le cuideam èadhair beagan adhartach anns na seòmraichean ro-PCR agus cuideam èadhair beagan àicheil anns na seòmraichean post-PCR.

Mu dheireadh, tha e cuideachail plana gealltanas càileachd (QA) a leasachadh.Bu chòir do phlana mar seo a bhith a’ toirt a-steach liostaichean de phrìomh stocan ath-bheachdan agus stoc obrach, riaghailtean airson stòradh innealan agus ath-bheachdan, aithris air toraidhean smachd, prògraman trèanaidh luchd-obrach, algoirmean fuasgladh cheistean, agus gnìomhan leigheas nuair a bhios feum orra.

6. Leabhar-chlàr

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Caibideil 3: A 'stèidheachadh obair-lann qPCR.Sgrìobhainn stiùiridh airson a bhith a’ dèanamh deuchainn air uisgeachan cur-seachad a’ cleachdadh modh USEPA qPCR 1611. Lansing- Oilthigh Stàite Michigan.

Slàinte Poblach Shasainn, SNS.Inbhean na RA airson sgrùdaidhean meanbh-bhitheòlas: Deagh chleachdadh obair-lann nuair a bhios tu a’ dèanamh mheasaidhean leudachaidh moileciuil).Stiùireadh Càileachd.2013; 4(4):1–15.

Mifflin T. A' stèidheachadh obair-lann PCR.Protoc cala fuar an earraich.2007;7.

Schroeder S 2013. Cumail suas àbhaisteach centrifuges: glanadh, cumail suas agus dì-ghalarachadh centrifuges, rotors agus innealan-atharrachaidh (Pàipear geal Àir. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Deagh Chleachdadh Obair-lann Clionaigeach (GCLP) airson deuchainnean stèidhichte air moileciuil air an cleachdadh ann an deuchainn-lannan breithneachaidh, Ann an: Akyar I, neach-deasachaidh.Spectra farsaing de smachd càileachd.Rijeka, Croatia: Intech;2011: 29–52.