Tá an cumas ag modhanna braite móilíneacha líon mór d'aigéad núicléach a tháirgeadh trí rianchainníochtaí a fhaightear i samplaí a aimpliú.Cé go bhfuil sé seo tairbheach chun braite íogair a chumasú, tugann sé isteach freisin an fhéidearthacht éillithe trí aerasóil aimpliúcháin a scaipeadh i dtimpeallacht na saotharlainne.Agus turgnaimh á ndéanamh, is féidir bearta a dhéanamh chun éilliú imoibrithe, trealamh saotharlainne agus spás binse a sheachaint, toisc go bhféadfadh éilliú den sórt sin torthaí bréagach-dearfach (nó bréagach-diúltach) a ghiniúint.

Chun an dóchúlacht go dtarlódh éilliúchán a laghdú, ba cheart Dea-Chleachtas Saotharlainne a fheidhmiú i gcónaí.Go sonrach, ba cheart réamhchúraimí a ghlacadh maidir leis na pointí seo a leanas:

1. Imoibrithe a láimhseáil
2. Eagrú spás oibre agus trealaimh
3. Comhairle úsáide agus glantacháin don spás móilíneach ainmnithe
4. Comhairle ghinearálta bitheolaíochta mhóilíneach
5. Rialuithe inmheánacha
6. Leabharliosta

1. Imoibrithe a láimhseáil

Go hachomair lártheifneoir feadáin imoibrí roimh oscailt chun giniúint aerasóil a sheachaint.Imoibrithe Aliquot a sheachaint leánn iolrach agus éilliú na stoc máistir.Lipéadaigh agus dáta go soiléir ar gach imoibrí agus feadáin imoibrithe agus coinnigh logaí de líon na n-imoibrí agus na mbaisc-uimhreacha a úsáidtear i ngach turgnamh.Píbéad gach imoibrí agus samplaí ag baint úsáide as leideanna scagaire.Sula gceannaítear é, moltar a dhearbhú leis an monaróir go n-oireann na leideanna scagaire don bhranda pípéad atá le húsáid.

2. Eagrú spás oibre agus trealaimh

Ba cheart spás oibre a eagrú chun a chinntiú go dtarlaíonn an sreabhadh oibre i dtreo amháin, ó limistéir ghlan (réamh-PCR) go limistéir salach (iar-PCR).Cabhróidh na réamhchúraimí ginearálta seo a leanas leis an seans éillithe a laghdú.Bíodh seomraí sainithe ar leith agat, nó íosmhéid limistéir atá leithleach go fisiciúil, le haghaidh: ullmhú máistir-mheascáin, eastóscadh aigéid núicléacha agus cur leis an teimpléad DNA, aimpliú agus láimhseáil táirge aimplithe, agus anailís táirge, m.sh. leictreafóiréis glóthach.

I roinnt suíomhanna, tá sé deacair 4 sheomra ar leith a bheith agat.Rogha féideartha ach nach bhfuil chomh inmhianaithe is ea ullmhúchán an mháistirmheascáin a dhéanamh i limistéar srianta, m.sh. comh-aireachta sreafa laminach.I gcás aimpliú PCR neadaithe, ba cheart ullmhú an mastermix don imoibriú dara babhta a ullmhú sa limistéar 'glan' le haghaidh ullmhú mastermix, ach ba cheart an ionaclú leis an táirge PCR bunscoile a dhéanamh sa seomra aimpliúcháin, agus más féidir. i limistéar tiomnaithe srianta (eg comh-aireachta sreafa laminach).

Teastaíonn sraith ar leith de phípéid, leideanna scagaire, racaí feadáin, vortexes, lártheifneoirí (más ábhartha), pinn, imoibrithe saotharlainne cineálacha, cótaí saotharlainne agus boscaí lámhainní a fhanfaidh ag a stáisiúin oibre faoi seach de dhíth ar gach seomra/limistéar.Ní mór lámha a ní agus lámhainní agus cótaí saotharlainne a athrú agus iad ag bogadh idir na limistéir ainmnithe.Níor cheart imoibrithe agus trealamh a aistriú ó áit shalach go limistéar glan.Má thagann cás an-mhór chun cinn nuair is gá imoibrí nó píosa trealaimh a bhogadh ar gcúl, ní mór é a dhí-éilliú ar dtús le fochlóirít sóidiam 10%, agus é a ghlanadh le huisce steiriúil ina dhiaidh sin.

Nóta

Ní mór an tuaslagán fochlóiríte sóidiam 10% a dhéanamh suas go laethúil úr.Nuair a úsáidtear é le haghaidh dí-éillithe, ba cheart cloí le 10 nóiméad ar a laghad ama teagmhála.
De rogha air sin, is féidir táirgí atá ar fáil ar an tráchtála agus atá bailíochtaithe mar dhíshalaithe dromchla a scriosann DNA a úsáid mura gceadaíonn moltaí sábháilteachta áitiúla úsáid a bhaint as fochlóirít sóidiam nó mura bhfuil fochlóirít sóidiam oiriúnach chun codanna miotalacha an trealaimh a dhí-éilliú.

Go hidéalach, ba cheart go gcloífeadh an fhoireann leis an éiteas sreabhadh oibre aontreoch agus gan dul ó limistéir shalach (iar-PCR) ar ais go dtí limistéir ghlana (réamh-PCR) an lá céanna.Mar sin féin, d'fhéadfadh go mbeadh ócáidí ann nuair nach féidir é seo a sheachaint.Nuair a thagann ócáid ​​den sórt sin chun cinn, caithfidh pearsanra a bheith cúramach lámha a ní go críochnúil, lámhainní a athrú, an cóta saotharlainne ainmnithe a úsáid agus gan aon trealamh a bheidh siad ag iarraidh a thógáil amach as an seomra a thabhairt isteach arís, mar leabhair saotharlainne.Ba cheart béim a chur ar bhearta rialaithe den sórt sin in oiliúint foirne ar mhodhanna móilíneacha.

Tar éis é a úsáid, ba cheart spásanna binse a ghlanadh le fochlóirít sóidiam 10% (agus uisce steiriúil ina dhiaidh sin chun bleach iarmharach a bhaint), eatánól 70%, nó dí-éillitheoir bailíochtaithe a scriosann DNA atá ar fáil go tráchtála.Go hidéalach, ba cheart lampaí ultraivialait (UV) a fheistiú chun dí-éilliú trí ionradaíocht a chumasú.Mar sin féin, ba cheart úsáid lampaí UV a theorannú chuig limistéir oibre dúnta, m.sh. caibinéid sábháilteachta, chun nochtadh UV na foirne saotharlainne a theorannú.Cloí le treoracha an déantóra maidir le cúram, aeráil agus glanadh lampa UV chun a chinntiú go bhfanann na lampaí éifeachtach.

Má úsáidtear eatánól 70% in ionad fochlóirít sóidiam, beidh gá le ionradaíocht le solas UV chun an dí-éilliú a chríochnú.
Ná glan an vortex agus lártheifneoir le fochlóirít sóidiam;ina ionad sin, wipe síos le eatánól 70% agus faoi lé solas UV, nó úsáid díshalaithe tráchtála DNA-scriosadh.Maidir le doirteadh, seiceáil leis an monaróir le haghaidh tuilleadh comhairle ghlantacháin.Má cheadaíonn treoracha an déantóra é, ba cheart pípéid a steiriliú go rialta le huathchláiv.Mura féidir pípéid a uathchlátáil, ba chóir go mbeadh sé leor iad a ghlanadh le fochlóirít sóidiam 10% (agus iad a ghlanadh go críochnúil le huisce steiriúil ina dhiaidh sin) nó le díshalaithe tráchtála a scriosann DNA agus nochtadh UV ina dhiaidh sin.

D'fhéadfadh glanadh le fochlóirít sóidiam ardchéatadáin damáiste a dhéanamh do phlaistigh agus do mhiotail pípéad ar deireadh má dhéantar é ar bhonn rialta;seiceáil moltaí ón monaróir ar dtús.Ní mór an trealamh go léir a chalabrú go rialta de réir an sceidil atá molta ag an monaróir.Ba cheart go mbeadh duine ainmnithe i gceannas ar a chinntiú go gcloítear leis an sceideal calabraithe, go gcoimeádtar logaí mionsonraithe, agus go bhfuil lipéid seirbhíse ar taispeáint go soiléir ar an trealamh.

3. Comhairle úsáide agus glantacháin don spás móilíneach ainmnithe

Réamh-PCR: Lonnú imoibrí / ullmhú máistir-mheascán: Ba chóir go mbeadh sé seo ar an gceann is glaine de na spásanna go léir a úsáidtear chun turgnaimh mhóilíneacha a ullmhú agus go hidéalach ba chóir go mbeadh sé ina chomh-aireachta sreafa laminach ainmnithe agus é feistithe le solas UV.Níor cheart samplaí, aigéad núicléach eastósctha agus táirgí PCR aimplithe a láimhseáil sa réimse seo.Ba cheart imoibrithe aimpliúcháin a choinneáil i reoiteoir (nó i gcuisneoir, de réir mholtaí an mhonaróra) sa spás ainmnithe céanna, go hidéalach in aice leis an gcomh-aireachta sreabhadh laminar nó limistéar réamh-PCR.Ba chóir lámhainní a athrú gach uair nuair a théann tú isteach sa limistéar réamh-PCR nó sa chomh-aireachta sreabhadh laminach.

Ba cheart an limistéar réamh-PCR nó an comh-aireachta sreabhadh laminar a ghlanadh roimh agus tar éis é a úsáid mar seo a leanas: Scrios síos gach mír sa chomh-aireachta, m.sh. pípéid, boscaí tip, vortex, lártheifneoir, racaí feadáin, pinn, etc. le 70% eatánól nó a tráchtála DNA-scriosadh dí-éillithe, agus a cheadú chun tirim.I gcás limistéar oibre dúnta, m.sh. comh-aireachta sreafa laminar, nochtaigh an cochall do sholas UV ar feadh 30 nóiméad.

Nóta

Ná nocht imoibrithe do sholas UV;ná bog isteach sa chomh-aireachta iad ach amháin nuair a bhíonn sé glan.Má tá PCR trascríobh droim ar ais á déanamh agat, d’fhéadfadh sé a bheith ina chuidiú freisin dromchlaí agus trealamh a ghlanadh le tuaslagán a bhriseann RNAses ar theagmháil.D'fhéadfadh sé seo cabhrú le torthaí bréagach-diúltacha a sheachaint ó dhíghrádú einsíme RNA.Tar éis dí-éillithe agus roimh an mastermix a ullmhú, ba chóir lámhainní a athrú arís, agus ansin tá an comh-aireachta réidh le húsáid.

Réamh-PCR: Eastóscadh aigéid núicléigh/leasú teimpléid:

Ní mór aigéad núicléasach a bhaint as agus a láimhseáil sa dara limistéar ainmnithe, ag baint úsáide as sraith ar leith de phípéid, leideanna scagaire, racaí feadáin, lámhainní úra, cótaí saotharlainne agus trealamh eile. Tá an réimse seo freisin chun teimpléad, rialuithe agus línte treochta a chur leis an feadáin nó plátaí mastermix.Chun éilliú na samplaí aigéid núicléacha eastósctha atá á n-anailís a sheachaint, moltar lámhainní a athrú sula láimhseálann tú rialuithe dearfacha nó caighdeáin deimhneacha agus úsáid a bhaint as sraith pípéad ar leith.Níor cheart imoibrithe PCR agus táirgí aimplithe a phíobáil sa réimse seo.Ba cheart samplaí a stóráil i gcuisneoirí nó reoiteoirí ainmnithe sa limistéar céanna.Ba cheart an spás oibre samplach a ghlanadh ar an mbealach céanna leis an spás mastermix.

Iar-PCR: Aimpliú agus láimhseáil an táirge aimplithe

Tá an spás sainithe seo le haghaidh próisis iar-aimplithe agus ba cheart é a bheith scartha go fisiciúil ó na limistéir réamh-PCR.De ghnáth bíonn teirmeoirí agus ardáin fíor-ama ann, agus go hidéalach ba cheart go mbeadh comh-aireachta sreabhadh laminar ann chun an táirge PCR bhabhta 1 a chur leis an imoibriú babhta 2, má tá PCR neadaithe á dhéanamh.Ní cóir imoibrithe PCR agus aigéad núicléach eastósctha a láimhseáil sa réimse seo ós rud é go bhfuil an baol éillithe ard.Ba cheart go mbeadh sraith ar leith de lámhainní, cótaí saotharlainne, racaí pláta agus feadáin, pípéid, leideanna scagaire, boscaí bruscair agus trealamh eile sa limistéar seo.Ní mór feadáin a lártheifneoiriú roimh oscailt.Ba cheart an spás oibre samplach a ghlanadh ar an mbealach céanna leis an spás mastermix.

Iar-PCR: Anailís táirge

Tá an seomra seo le haghaidh trealamh braite táirgí, m.sh. umair leictreafóiréis glóthach, pacaí cumhachta, trasilluminator UV agus an córas doiciméadaithe glóthacha.Ba cheart go mbeadh tacair ar leith de lámhainní, cótaí saotharlainne, racaí pláta agus feadáin, pípéid, leideanna scagaire, boscaí bruscair agus trealamh eile sa limistéar seo.Ní féidir aon imoibrithe eile a thabhairt isteach sa réimse seo, gan lí luchtaithe, marcóir móilíneach agus glóthach agarose, agus comhpháirteanna maolánacha a áireamh.Ba cheart an spás oibre samplach a ghlanadh ar an mbealach céanna leis an spás mastermix.

Nóta tábhachtach

Go hidéalach, níor cheart na seomraí réamhPCR a chur isteach ar an lá céanna má tá obair déanta cheana féin sna seomraí iar-PCR.Mura féidir é seo a sheachaint, cinntigh go nitear na lámha go críochnúil ar dtús agus go gcaitear cótaí saotharlainne ar leith sna seomraí.Níor cheart leabhair saotharlainne agus páipéarachas a thabhairt isteach sna seomraí réamhPCR má úsáideadh iad sna seomraí iar-PCR;más gá, bain dúblach as prótacail/aitheantais samplacha, etc.

4. Comhairle ghinearálta bitheolaíochta mhóilíneach

Úsáid lámhainní saor ó phúdar chun cosc ​​ar mheasúnacht a sheachaint.Tá teicníocht cheart píopaithe ríthábhachtach chun éilliú a laghdú.D'fhéadfadh splancadh a bheith mar thoradh ar phíbeáil mhícheart nuair a bhíonn leachtanna á dháileadh agus nuair a chruthaítear aerasóil.Is féidir dea-chleachtas maidir le píbeáil cheart a fháil ag na naisc seo a leanas: Treoir Gilson ar phíbeáil, físeáin ar theicnící píbéireachta Anachem, feadáin lártheifneora roimh oscailt, agus iad a oscailt go cúramach chun splancadh a sheachaint.Dún na feadáin díreach tar éis iad a úsáid chun tabhairt isteach ábhar salaithe a sheachaint.

Agus imoibrithe iolracha á ndéanamh agat, ullmhaigh máistir-mheascán amháin ina bhfuil imoibrithe coitianta (eg uisce, dNTPanna, maolán, primers agus einsím) chun líon na n-aistrithe imoibrí a íoslaghdú agus an bhagairt éillithe a laghdú.Moltar an mastermix a chur ar bun ar oighear nó bloc fuar.D’fhéadfadh úsáid einsím Hot Start cabhrú le táirgeadh táirgí neamhshonracha a laghdú.Imoibrithe a bhfuil tóireadóirí fluaraiseacha iontu a chosaint ó sholas chun díghrádú a sheachaint.

5. Rialuithe inmheánacha

Áirigh rialuithe dea-thréithrithe, deimhnithe dearfacha agus diúltacha, mar aon le rialú gan teimpléid i ngach imoibriú, agus treochtlíne toirtmheasctha ilphointí d'imoibrithe cainníochtúla.Níor cheart go mbeadh an rialú dearfach chomh láidir sin go mbaineann riosca éillithe leis.Áirigh rialuithe eastósctha dearfacha agus diúltacha agus eastóscadh aigéid núicléigh á dhéanamh.

Moltar treoracha soiléire a phostáil i ngach ceann de na réimsí ionas go mbeidh úsáideoirí ar an eolas faoi rialacha iompair.B'fhéidir gur mhaith le saotharlanna diagnóiseacha a bhraitheann leibhéil an-íseal DNA nó RNA i samplaí cliniciúla an beart slándála breise a ghlacadh chun córais láimhseála aeir ar leithligh a bheith acu le brú aeir beagán dearfach sna seomraí réamh-PCR agus brú aeir beagán diúltach sna seomraí iar-PCR.

Ar deireadh, tá sé ina chuidiú plean dearbhaithe cáilíochta (QA) a fhorbairt.Ba cheart go n-áireofaí i bplean den sórt sin liostaí de stoic máistir agus stoic oibre imoibrí, rialacha maidir le feisteáin agus imoibrithe a stóráil, tuairisciú ar thorthaí rialaithe, cláir oiliúna foirne, algartaim fabhtcheartaithe, agus gníomhaíochtaí feabhais nuair is gá.

6. Leabharliosta

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Caibidil 3: Saotharlann qPCR a chur ar bun.Doiciméad treorach chun uiscí áineasa a thástáil ag baint úsáide as modh qPCR USEPA 1611. Lansing- Ollscoil Stáit Michigan....

Sláinte Poiblí Sasana, NHS.Caighdeáin RA maidir le himscrúduithe micribhitheolaíochta: Dea-Chleachtas Saotharlainne nuair a bhíonn measúnuithe aimpliúcháin móilíneacha á ndéanamh).Treoir Cáilíochta.2013; 4(4):1–15.

Mifflin T. Saotharlann PCR a bhunú.Prótacal Cuan Earraigh Fuar.2007;7.

Schroeder S 2013. Cothabháil ghnáthamh lártheifneoirí: lártheifneoirí, rotors agus oiriúntóirí a ghlanadh, a chothabháil agus a dhíghalrú (Páipéar Bán Uimh. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Dea-Chleachtas Saotharlainne Cliniciúil (GCLP) le haghaidh tástálacha móilíneach-bhunaithe a úsáidtear i saotharlanna diagnóiseacha, In: Akyar I, eagarthóir.Speictream leathan de rialú cáilíochta.Rijeka, an Chróit: Intech;2011: 29–52.