Molekulêre deteksjemetoaden hawwe de mooglikheid om in grut folume fan nukleïnesûr te produsearjen troch de amplifikaasje fan spoarhoeveelheden fûn yn samples.Hoewol dit foardielich is foar it ynskeakeljen fan gefoelige deteksje, yntrodusearret it ek de mooglikheid fan fersmoarging troch it fersprieden fan amplifikaasjeaerosolen yn 'e laboratoariumomjouwing.By it útfieren fan eksperiminten kinne maatregels wurde nommen om de kontaminaasje fan reagentia, laboratoariumapparatuer en bankromte te foarkommen, om't sa'n fersmoarging falsk-positive (as falsk-negative) resultaten kin generearje.

Om de kâns op fersmoarging te helpen ferminderjen, moatte Good Laboratory Practice te alle tiden wurde útoefene.Spesifyk moatte foarsoarchsmaatregels wurde nommen oangeande de folgjende punten:

1. Omgean reagents
2. Organisaasje fan wurkromte en apparatuer
3. Brûk en skjinmeitsjen advys foar de oanwiisde molekulêre romte
4. Algemiene molekulêre biology advys
5. Ynterne kontrôles
6. Bibliografy

1. Omgean reagents

Centrifuge reagensbuizen koart foardat se iepenje om de generaasje fan aerosolen te foarkommen.Aliquot reagents om meardere freeze-thaws en de fersmoarging fan masterstocks te foarkommen.Labelje en datearje alle reagens- en reaksjebuizen dúdlik en ûnderhâlde logs fan reagenslot en batchnûmers brûkt yn alle eksperiminten.Pipetteer alle reagenzjes en samples mei filtertips.Foarôfgeand oan oankeap is it oan te rieden om te befestigjen mei de fabrikant dat de filtertips passe by it te brûken pipettemerk.

2. Organisaasje fan wurkromte en apparatuer

Wurkromte moat wurde organisearre om te soargjen dat de stream fan wurk yn ien rjochting bart, fan skjinne gebieten (pre-PCR) oant smoarge gebieten (post-PCR).De folgjende algemiene foarsoarchsmaatregels sille helpe om de kâns op kontaminaasje te ferminderjen.Hawwe aparte oanwiisde keamers, of op syn minst fysyk aparte gebieten, foar: mastermix tarieding, nucleic acid ekstraksje en DNA template tafoeging, amplification en ôfhanneljen fan fersterke produkt, en produkt analyze, bygelyks gel electrophoresis.

Yn guon ynstellings is it lestich om 4 aparte keamers te hawwen.In mooglike, mar minder winsklike opsje is om de mastermix-tarieding te dwaan yn in befettingsgebiet, bygelyks in laminêre streamkast.Yn it gefal fan nestele PCR-amplifikaasje moat de tarieding fan 'e mastermix foar de twadde ronde-reaksje wurde taret yn it 'skjinne' gebiet foar mastermix-tarieding, mar de ynokulaasje mei it primêre PCR-produkt moat dien wurde yn 'e amplifikaasjekeamer, en as mooglik yn in tawijd befettingsgebiet (bygelyks in laminêre streamkast).

Eltse keamer / gebiet hat in aparte set fan dúdlik bestimpele pipetten, filter tips, tube racks, vortexes, centrifuges (as relevant), pennen, generike lab reagents, lab jassen en doazen fan wanten dy't sille bliuwe op harren respektive wurkstasjons.Hannen moatte wosken wurde en wanten en labjassen wurde feroare by it ferpleatsen tusken de oanwiisde gebieten.Reagentia en apparatuer moatte net ferpleatst wurde fan in smoarch gebiet nei in skjin gebiet.Mocht der in ekstreem gefal ûntstean dêr't in reagens of stikje apparatuer nei efteren ferpleatst wurde moat, dan moat it earst dekontaminearre wurde mei 10% natriumhypochlorite, folge troch in ôfwike mei sterile wetter.

Noat

De 10% natriumhypochlorite-oplossing moat deistich fris makke wurde.As brûkt foar dekontaminaasje, moat in minimale kontakttiid fan 10 minuten oanhâlden wurde.
As alternatyf kinne kommersjeel beskikbere produkten dy't falidearre binne as DNA-ferneatigjende oerflakdekontaminanten wurde brûkt as lokale feiligensoanbefellings it gebrûk fan natriumhypochlorite net tastean of as natriumhypochlorite net geskikt is foar it dekontaminearjen fan de metalen dielen fan apparatuer.

Ideaallik soe it personiel de unidirectional workflow-etos hâlde moatte en net op deselde dei fan smoarge gebieten (post-PCR) werom nei skjinne gebieten (pre-PCR) gean.D'r kinne lykwols gelegenheden wêze dat dit net te ûntkommen is.Wannear't sa'n gelegenheid him foarkomt, moat it personiel der foar soargje om de hannen goed te waskjen, wanten te feroarjen, de oanwiisde labjas te brûken en gjin apparatuer yntrodusearje dy't se wer út 'e keamer nimme wolle, lykas labboeken.Sokke kontrôlemaatregels moatte beklamme wurde yn training fan personiel oer molekulêre metoaden.

Nei gebrûk moatte bankromten wurde skjinmakke mei 10% natriumhypochlorite (folge troch sterile wetter om oerbleaun bleekmiddel te ferwiderjen), 70% ethanol, of in falidearre kommersjeel beskikber DNA-ferneatigjende dekontaminant.Ideal moatte ultraviolet (UV) lampen wurde ynrjochte om dekontaminaasje troch bestraling mooglik te meitsjen.It gebrûk fan UV-lampen soe lykwols moatte wurde beheind ta sletten wurkgebieten, bygelyks feiligenskasten, om de UV-eksposysje fan it laboratoariumpersoniel te beheinen.Folgje asjebleaft de ynstruksjes fan de fabrikant foar soarch, fentilaasje en skjinmeitsjen fan UV-lampen om te soargjen dat lampen effektyf bliuwe.

As jo ​​​​70% ethanol brûke ynstee fan natriumhypochlorite, sil bestraling mei UV-ljocht nedich wêze om de dekontaminaasje te foltôgjen.
Net skjinmeitsje de vortex en centrifuge mei natrium hypochlorite;ynstee, wipe del mei 70% ethanol en bleatstelle oan UV ljocht, of brûk in kommersjele DNA-ferneatigjende decontaminant.Foar spillingen, kontrolearje mei de fabrikant foar fierdere reinigingsadvys.As de ynstruksjes fan de fabrikant it tastean, moatte pipetten regelmjittich sterilisearre wurde troch autoklaaf.As pipetten net autoklaveare wurde kinne, soe it genôch wêze moatte om se te skjin te meitsjen mei 10% natriumhypochlorite (folge troch in yngeand wipe mei sterile wetter) of mei in kommersjele DNA-ferneatigjende dekontaminant folge troch UV-eksposysje.

Cleaning mei hege-persintaazje natrium hypochlorite kin úteinlik skea pipet plestik en metalen as dien op in reguliere basis;kontrolearje earst oanbefellings fan de fabrikant.Alle apparatuer moat regelmjittich kalibreare wurde neffens it troch de fabrikant oanrikkemandearre skema.In oanwiisde persoan soe ferantwurdlik wêze moatte foar it garandearjen dat it kalibraasjeskema wurdt folge, detaillearre logs wurde byhâlden, en serviceetiketten wurde dúdlik werjûn op apparatuer.

3. Brûk en skjinmeitsjen advys foar de oanwiisde molekulêre romte

Pre-PCR: Reagent aliquoting / mastermix tarieding: Dit moat de skjinste wêze fan alle romten dy't brûkt wurde foar de tarieding fan molekulêre eksperiminten en soe ideaal wêze moatte in oanwiisde laminêre streamkabinet útrist mei in UV-ljocht.Samples, extracted nucleic acid en amplified PCR-produkten moatte net wurde behannele yn dit gebiet.Amplification reagents moatte wurde bewarre yn in friezer (of kuolkast, as per fabrikant oanbefellings) yn deselde oanwiisde romte, by útstek neist de laminar flow kabinet of pre-PCR gebiet.Handschoenen moatte elke kear feroare wurde by it ynfieren fan it pre-PCR-gebiet of laminêre streamkabinet.

It pre-PCR-gebiet of laminêre streamkast moat foar en nei gebrûk as folget skjinmakke wurde: Veeg alle items yn 'e kast ôf, bygelyks pipetten, tipdoazen, vortex, sintrifuge, buisrekken, pennen, ensfh. kommersjele DNA-ferneatigjende decontaminant, en lit droegje.Yn it gefal fan in sletten wurkgebiet, bygelyks in laminêre streamkast, bleatstelle de kap foar 30 minuten oan UV-ljocht.

Noat

Reagents net bleatstelle oan UV-ljocht;ferpleatse se allinich yn it kabinet as it skjin is.As it útfieren fan omkearde transkripsje PCR, kin it ek nuttich wêze om oerflakken en apparatuer te wiskjen mei in oplossing dy't RNases by kontakt ôfbrekt.Dit kin helpe om falsk-negative resultaten te foarkommen fan enzymdegradaasje fan RNA.Nei dekontaminaasje en foar it tarieden fan 'e mastermix moatte de handschoenen nochris feroare wurde, en dan is it kabinet klear foar gebrûk.

Pre-PCR: Nukleïnezuurekstraksje / tafoeging fan sjabloanen:

Nucleic acid moat wurde ekstrahearre en behannele yn in twadde oanwiisd gebiet, mei help fan in aparte set fan pipetten, filter tips, tube racks, farske wanten, lab jassen en oare apparatuer. mastermix buizen of platen.Om kontaminaasje te foarkommen fan 'e ekstrahearre nukleïnsûrmonsters dy't wurde analysearre, wurdt it oanrikkemandearre om handschoenen te feroarjen foardat jo positive kontrôles as noarmen behannelje en in aparte set pipetten brûke.PCR-reagenzjes en fersterke produkten meie net yn dit gebiet pipetteare wurde.Samples moatte wurde opslein yn oanwiisde kuolkasten of friezers yn itselde gebiet.De sample wurkromte moat wurde skjinmakke op deselde wize as de mastermix romte.

Post-PCR: Amplifikaasje en behanneling fan it fersterke produkt

Dizze oanwiisde romte is foar post-amplifikaasjeprosessen en moat fysyk apart wêze fan 'e pre-PCR-gebieten.It befettet meastentiids thermocyclers en real-time platfoarms, en ideaal moat hawwe in laminar flow kabinet foar it tafoegjen fan de rûne 1 PCR produkt oan de rûne 2 reaksje, as nested PCR wurdt útfierd.PCR-reagenzjes en ekstrahearre nukleïnesûr moatte yn dit gebiet net wurde behannele, om't it risiko op kontaminaasje heech is.Dit gebiet moat in aparte set fan wanten, lab jassen, plaat en buis rekkens, pipetten, filter tips, bins en oare apparatuer.Tubes moatte wurde sintrifuge foardat iepening.De sample wurkromte moat wurde skjinmakke op deselde wize as de mastermix romte.

Post-PCR: Produktanalyse

Dizze keamer is foar produktdeteksjeapparatuer, bygelyks gelelektroforesetanks, power packs, UV-transilluminator en it geldokumintaasjesysteem.Dit gebiet moat hawwe aparte sets fan wanten, lab jassen, plaat en buis rekkens, pipetten, filter tips, bins en oare apparatuer.Gjin oare reagents kinne wurde brocht yn dit gebiet, útsein laden kleurstof, molekulêre marker en agarose gel, en buffer komponinten.De sample wurkromte moat wurde skjinmakke op deselde wize as de mastermix romte.

Wichtige notysje

Ideaallik moatte de pre-PCR-keamers net op deselde dei ynfierd wurde as der al wurk is útfierd yn 'e post-PCR-keamers.As dit folslein net te ûntkommen is, soargje derfoar dat de hannen earst goed wosken wurde en dat spesifike labjassen yn 'e keamers droegen wurde.Labboeken en papierwurk moatte net yn 'e pre-PCR-keamers wurde nommen as se binne brûkt yn' e post-PCR-keamers;as it nedich is, nim dûbele printsjes fan protokollen / sample ID's, ensfh.

4. Algemiene molekulêre biology advys

Brûk poederfrije handschoenen om assay-ynhibysje te foarkommen.Korrekte pipettingtechnyk is essensjeel foar it ferminderjen fan fersmoarging.Ferkearde pipetting kin resultearje yn spatten by it útjaan fan floeistoffen en it meitsjen fan aerosolen.Goede praktyk foar korrekt pipetterjen is te finen op de folgjende keppelings: Gilson-gids foar pipetting, fideo's fan Anachem-pipettingtechnyk, Centrifuge-buizen foar it iepenjen, en iepenje se foarsichtich om spatten te foarkommen.Slút buizen fuortendaliks nei gebrûk om de ynfiering fan kontaminanten te foarkommen.

As jo ​​​​meardere reaksjes útfiere, meitsje dan ien mastermix tariede mei mienskiplike reagenzjes (bgl. wetter, dNTP's, buffer, primers en enzyme) om it oantal reagenstransfers te minimalisearjen en de bedriging fan kontaminaasje te ferminderjen.It is oan te rieden om de mastermix op iis of in kâld blok te setten.Gebrûk fan in Hot Start-enzyme kin helpe om de produksje fan net-spesifike produkten te ferminderjen.Beskermje reagenzjes dy't fluorescent probes befetsje tsjin ljocht om degradaasje te foarkommen.

5. Ynterne kontrôles

Omfetsje goed karakterisearre, befêstige positive en negative kontrôles, tegearre mei in kontrôle sûnder sjabloan yn alle reaksjes, en in titrearre trendline mei meardere punten foar kwantitative reaksjes.De positive kontrôle moat net sa sterk wêze dat it in besmettingsrisiko foarmet.Omfetsje positive en negative ekstraksjekontrôles by it útfieren fan nukleïnezuurekstraksje.

It wurdt oanrikkemandearre dat dúdlike ynstruksjes yn elk fan 'e gebieten pleatst wurde, sadat brûkers har bewust binne fan gedrachsregels.Diagnostyske laboratoaren dy't heul lege nivo's fan DNA of RNA yn klinyske samples detectearje wolle miskien de ekstra feiligensmaatregel oannimme fan it hawwen fan aparte luchtbehannelingsystemen mei in bytsje positive luchtdruk yn 'e pre-PCR-keamers en in bytsje negative luchtdruk yn' e post-PCR-keamers.

As lêste is it ûntwikkeljen fan in kwaliteitsfersekering (QA) plan nuttich.Sa'n plan moat listen mei reagensmaster-oandielen en wurkjende foarrieden omfetsje, regels foar it opslaan fan kits en reagentia, rapportaazje fan kontrôleresultaten, trainingsprogramma's foar personiel, algoritmen foar probleemoplossing, en reparearjende aksjes as nedich.

6. Bibliografy

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Haadstik 3: It opsetten fan in qPCR laboratoarium.In begelieding dokumint foar it testen fan rekreative wetters mei USEPA qPCR metoade 1611. Lansing- Michigan State University.

Folkssûnens Ingelân, NHS.UK noarmen foar mikrobiologyske ûndersiken: Goede laboratoariumpraktyk by it útfieren fan molekulêre amplifikaasjeassays).Kwaliteit Begelieding.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. It opsetten fan in PCR laboratoarium.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Routine ûnderhâld fan centrifuges: skjinmeitsjen, ûnderhâld en desinfeksje fan centrifuges, rotors en adapters (White paper No. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) foar molekulêre basearre testen brûkt yn diagnostyske laboratoaria, Yn: Akyar I, bewurker.Breed spektrum fan kwaliteit kontrôle.Rijeka, Kroaasje: Intech;2011: 29–52.