Les méthodes de détection moléculaire ont la capacité de produire un grand volume d'acide nucléique grâce à l'amplification des traces trouvées dans les échantillons.Bien que cela soit bénéfique pour permettre une détection sensible, cela introduit également la possibilité de contamination par la propagation d'aérosols d'amplification dans l'environnement du laboratoire.Lors de la réalisation d'expériences, des mesures peuvent être prises pour éviter la contamination des réactifs, de l'équipement de laboratoire et de l'espace de paillasse, car une telle contamination peut générer des résultats faussement positifs (ou faussement négatifs).

Pour aider à réduire la probabilité de contamination, les bonnes pratiques de laboratoire doivent être appliquées à tout moment.Plus précisément, des précautions doivent être prises concernant les points suivants :

1. Manipulation des réactifs
2. Organisation de l'espace de travail et des équipements
3. Conseils d'utilisation et de nettoyage de l'espace moléculaire désigné
4. Conseils généraux en biologie moléculaire
5. Contrôles internes
6. Bibliographie

1. Manipulation des réactifs

Centrifuger brièvement les tubes de réactifs avant de les ouvrir pour éviter la génération d'aérosols.Aliquoter les réactifs pour éviter les multiples congélations-décongélation et la contamination des stocks de référence.Étiquetez et datez clairement tous les réactifs et tubes de réaction et conservez des registres des numéros de lots et de lots de réactifs utilisés dans toutes les expériences.Pipeter tous les réactifs et échantillons à l'aide de pointes à filtre.Avant l'achat, il est conseillé de vérifier auprès du fabricant que les pointes à filtre correspondent à la marque de pipette à utiliser.

2. Organisation de l'espace de travail et des équipements

L'espace de travail doit être organisé de manière à garantir que le flux de travail se déroule dans une seule direction, des zones propres (pré-PCR) aux zones sales (post-PCR).Les précautions générales suivantes aideront à réduire les risques de contamination.Avoir des salles désignées séparées, ou au minimum des zones physiquement séparées, pour : la préparation du mastermix, l'extraction d'acide nucléique et l'ajout de matrice d'ADN, l'amplification et la manipulation du produit amplifié, et l'analyse du produit, par exemple l'électrophorèse sur gel.

Dans certains contextes, avoir 4 pièces séparées est difficile.Une option possible mais moins souhaitable est de faire la préparation du mastermix dans une zone de confinement, par exemple une hotte à flux laminaire.Dans le cas d'une amplification par PCR nichée, la préparation du mastermix pour la réaction du second tour doit être préparée dans la zone « propre » pour la préparation du mastermix, mais l'inoculation avec le produit de PCR primaire doit être effectuée dans la salle d'amplification, et si possible dans une zone de confinement dédiée (par exemple une hotte à flux laminaire).

Chaque pièce/zone a besoin d'un ensemble distinct de pipettes clairement étiquetées, de pointes de filtre, de portoirs de tubes, de vortex, de centrifugeuses (le cas échéant), de stylos, de réactifs de laboratoire génériques, de blouses de laboratoire et de boîtes de gants qui resteront à leurs postes de travail respectifs.Les mains doivent être lavées et les gants et les blouses de laboratoire changés lors des déplacements entre les zones désignées.Les réactifs et l'équipement ne doivent pas être déplacés d'une zone sale vers une zone propre.Dans un cas extrême où un réactif ou une pièce d'équipement doit être déplacé vers l'arrière, il doit d'abord être décontaminé avec de l'hypochlorite de sodium à 10 %, puis essuyé avec de l'eau stérile.

Note

La solution d'hypochlorite de sodium à 10 % doit être renouvelée chaque jour.En cas d'utilisation pour la décontamination, un temps de contact minimum de 10 minutes doit être respecté.
Alternativement, des produits disponibles dans le commerce et validés comme décontaminants de surface destructeurs d'ADN peuvent être utilisés si les recommandations de sécurité locales ne permettent pas l'utilisation d'hypochlorite de sodium ou si l'hypochlorite de sodium ne convient pas pour décontaminer les parties métalliques de l'équipement.

Idéalement, le personnel devrait respecter la philosophie du flux de travail unidirectionnel et ne pas retourner des zones sales (post-PCR) aux zones propres (pré-PCR) le même jour.Cependant, il peut y avoir des occasions où cela est inévitable.Lorsqu'une telle occasion se présente, le personnel doit prendre soin de se laver soigneusement les mains, de changer de gants, d'utiliser la blouse de laboratoire désignée et de ne pas introduire d'équipement qu'il voudra à nouveau sortir de la pièce, comme des livres de laboratoire.Ces mesures de contrôle devraient être soulignées dans la formation du personnel sur les méthodes moléculaires.

Après utilisation, les espaces de paillasse doivent être nettoyés avec de l'hypochlorite de sodium à 10 % (suivi d'eau stérile pour éliminer l'eau de Javel résiduelle), de l'éthanol à 70 % ou un décontaminant destructeur d'ADN validé et disponible dans le commerce.Idéalement, des lampes ultraviolettes (UV) devraient être installées pour permettre la décontamination par irradiation.Cependant, l'utilisation de lampes UV doit être limitée aux zones de travail fermées, par exemple les armoires de sécurité, afin de limiter l'exposition aux UV du personnel du laboratoire.Veuillez respecter les instructions du fabricant pour l'entretien, la ventilation et le nettoyage des lampes UV afin de garantir que les lampes restent efficaces.

Si vous utilisez de l'éthanol à 70 % au lieu de l'hypochlorite de sodium, une irradiation aux rayons UV sera nécessaire pour compléter la décontamination.
Ne nettoyez pas le vortex et la centrifugeuse avec de l'hypochlorite de sodium ;au lieu de cela, essuyez avec 70% d'éthanol et exposez à la lumière UV, ou utilisez un décontaminant commercial destructeur d'ADN.Pour les déversements, consultez le fabricant pour obtenir des conseils de nettoyage supplémentaires.Si les instructions du fabricant le permettent, les pipettes doivent être systématiquement stérilisées à l'autoclave.Si les pipettes ne peuvent pas être autoclavées, il suffit de les nettoyer avec de l'hypochlorite de sodium à 10 % (suivi d'un essuyage minutieux avec de l'eau stérile) ou avec un décontaminant commercial destructeur d'ADN suivi d'une exposition aux UV.

Le nettoyage avec de l'hypochlorite de sodium à haut pourcentage peut éventuellement endommager les plastiques et les métaux des pipettes s'il est effectué régulièrement ;vérifiez d'abord les recommandations du fabricant.Tous les équipements doivent être calibrés régulièrement selon le calendrier recommandé par le fabricant.Une personne désignée doit être chargée de s'assurer que le calendrier d'étalonnage est respecté, que des journaux détaillés sont conservés et que les étiquettes d'entretien sont clairement affichées sur l'équipement.

3. Conseils d'utilisation et de nettoyage de l'espace moléculaire désigné

Pré-PCR : aliquotage des réactifs/préparation du mélange maître : cet espace doit être le plus propre de tous les espaces utilisés pour la préparation d'expériences moléculaires et devrait idéalement être une hotte à flux laminaire désignée équipée d'une lumière UV.Les échantillons, les acides nucléiques extraits et les produits PCR amplifiés ne doivent pas être manipulés dans cette zone.Les réactifs d'amplification doivent être conservés dans un congélateur (ou un réfrigérateur, selon les recommandations du fabricant) dans le même espace désigné, idéalement à côté de l'enceinte à flux laminaire ou de la zone de pré-PCR.Les gants doivent être changés à chaque entrée dans la zone de pré-PCR ou dans la hotte à flux laminaire.

La zone de pré-PCR ou la hotte à flux laminaire doit être nettoyée avant et après utilisation comme suit : décontaminant commercial destructeur d'ADN et laisser sécher.Dans le cas d'une zone de travail fermée, par exemple une hotte à flux laminaire, exposer la hotte à la lumière UV pendant 30 minutes.

Note

Ne pas exposer les réactifs à la lumière UV ;ne les placez dans l'armoire qu'une fois qu'elle est propre.Si vous effectuez une PCR de transcription inverse, il peut également être utile d'essuyer les surfaces et l'équipement avec une solution qui décompose les RNases au contact.Cela peut aider à éviter les résultats faussement négatifs de la dégradation enzymatique de l'ARN.Après la décontamination et avant de préparer le mastermix, les gants doivent être changés une fois de plus, puis l'armoire est prête à l'emploi.

Pré-PCR : Extraction d'acide nucléique/ajout de matrice :

L'acide nucléique doit être extrait et manipulé dans une deuxième zone désignée, à l'aide d'un ensemble séparé de pipettes, d'embouts à filtre, de supports de tubes, de gants frais, de blouses de laboratoire et d'autres équipements. Cette zone est également destinée à l'ajout de modèles, de contrôles et de lignes de tendance au tubes ou plaques mastermix.Pour éviter la contamination des échantillons d'acide nucléique extraits qui sont analysés, il est recommandé de changer de gants avant de manipuler les contrôles positifs ou les standards et d'utiliser un jeu de pipettes séparé.Les réactifs PCR et les produits amplifiés ne doivent pas être pipetés dans cette zone.Les échantillons doivent être conservés dans des réfrigérateurs ou des congélateurs désignés dans la même zone.L'espace de travail de l'échantillon doit être nettoyé de la même manière que l'espace du mastermix.

Post-PCR : Amplification et manipulation du produit amplifié

Cet espace désigné est destiné aux processus de post-amplification et doit être physiquement séparé des zones de pré-PCR.Il contient généralement des thermocycleurs et des plates-formes en temps réel, et devrait idéalement avoir une hotte à flux laminaire pour ajouter le produit PCR du tour 1 à la réaction du tour 2, si la PCR imbriquée est en cours.Les réactifs PCR et l'acide nucléique extrait ne doivent pas être manipulés dans cette zone car le risque de contamination est élevé.Cette zone doit disposer d'un ensemble séparé de gants, de blouses de laboratoire, de portoirs pour plaques et tubes, de pipettes, de pointes de filtres, de bacs et d'autres équipements.Les tubes doivent être centrifugés avant ouverture.L'espace de travail de l'échantillon doit être nettoyé de la même manière que l'espace du mastermix.

Post-PCR : Analyse du produit

Cette salle est destinée aux équipements de détection des produits, par exemple les réservoirs d'électrophorèse sur gel, les blocs d'alimentation, le transilluminateur UV et le système de documentation du gel.Cette zone doit avoir des ensembles séparés de gants, de blouses de laboratoire, de supports pour plaques et tubes, de pipettes, de pointes de filtre, de bacs et d'autres équipements.Aucun autre réactif ne peut être introduit dans cette zone, à l'exception du colorant de chargement, du marqueur moléculaire et du gel d'agarose, et des composants tampons.L'espace de travail de l'échantillon doit être nettoyé de la même manière que l'espace du mastermix.

Note importante

Idéalement, les salles pré-PCR ne doivent pas être entrées le même jour si des travaux ont déjà été effectués dans les salles post-PCR.Si cela est absolument inévitable, assurez-vous que les mains sont d'abord soigneusement lavées et que des blouses de laboratoire spécifiques sont portées dans les chambres.Les livres et documents de laboratoire ne doivent pas être emportés dans les salles pré-PCR s'ils ont été utilisés dans les salles post-PCR ;si nécessaire, prenez des copies imprimées des protocoles/ID d'échantillons, etc.

4. Conseils généraux en biologie moléculaire

Utiliser des gants non poudrés pour éviter l'inhibition du dosage.Une technique de pipetage correcte est primordiale pour réduire la contamination.Un pipetage incorrect peut entraîner des éclaboussures lors de la distribution de liquides et la création d'aérosols.Les bonnes pratiques pour un pipetage correct peuvent être trouvées sur les liens suivants : Guide Gilson pour le pipetage, Vidéos sur la technique de pipetage Anachem, Centrifuger les tubes avant de les ouvrir, et les ouvrir avec précaution pour éviter les éclaboussures.Fermer les tubes immédiatement après utilisation pour éviter l'introduction de contaminants.

Lorsque vous effectuez plusieurs réactions, préparez un mastermix contenant des réactifs communs (par exemple, eau, dNTP, tampon, amorces et enzyme) pour minimiser le nombre de transferts de réactifs et réduire le risque de contamination.Il est recommandé de mettre en place le mastermix sur de la glace ou un bloc froid.L'utilisation d'une enzyme Hot Start peut aider à réduire la production de produits non spécifiques.Protéger les réactifs contenant des sondes fluorescentes de la lumière afin d'éviter leur dégradation.

5. Contrôles internes

Inclure des contrôles positifs et négatifs bien caractérisés et confirmés, ainsi qu'un contrôle sans modèle dans toutes les réactions, et une ligne de tendance titrée en plusieurs points pour les réactions quantitatives.Le contrôle positif ne doit pas être si fort qu'il présente un risque de contamination.Inclure des contrôles d'extraction positifs et négatifs lors de l'extraction d'acide nucléique.

Il est recommandé d'afficher des consignes claires dans chacune des zones afin que les usagers connaissent les règles de conduite.Les laboratoires de diagnostic détectant de très faibles niveaux d'ADN ou d'ARN dans des échantillons cliniques peuvent souhaiter adopter la mesure de sécurité supplémentaire consistant à disposer de systèmes de traitement de l'air séparés avec une pression d'air légèrement positive dans les salles de pré-PCR et une pression d'air légèrement négative dans les salles de post-PCR.

Enfin, l'élaboration d'un plan d'assurance qualité (AQ) est utile.Un tel plan devrait inclure des listes de stocks de référence de réactifs et de stocks de travail, des règles de stockage des kits et des réactifs, des rapports sur les résultats des contrôles, des programmes de formation du personnel, des algorithmes de dépannage et des actions correctives si nécessaire.

6. Bibliographie

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Chapitre 3 : Mise en place d'un laboratoire de qPCR.Un document d'orientation pour tester les eaux récréatives à l'aide de la méthode USEPA qPCR 1611. Lansing- Michigan State University.

Santé publique Angleterre, NHS.Normes britanniques pour les investigations microbiologiques : bonnes pratiques de laboratoire lors de la réalisation d'essais d'amplification moléculaire).Orientation qualité.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Mise en place d'un laboratoire PCR.Cold Spring Harb Protocole.2007;7.

Schroeder S 2013. Maintenance de routine des centrifugeuses : nettoyage, maintenance et désinfection des centrifugeuses, rotors et adaptateurs (Livre blanc n° 14).Hambourg : Eppendorf ;2013.

Viana RV, Valais CL.Bonnes pratiques de laboratoire clinique (GCLP) pour les tests moléculaires utilisés dans les laboratoires de diagnostic, In: Akyar I, éditeur.Large spectre de contrôle qualité.Rijeka, Croatie : Intech ;2011 : 29–52.