Molekyylihavaintomenetelmillä on kyky tuottaa suuri määrä nukleiinihappoa monistamalla näytteistä löydettyjä pieniä määriä.Vaikka tämä on hyödyllistä herkän havaitsemisen mahdollistamiseksi, se tuo myös mahdollisuuden kontaminaatioon monistusaerosolien leviämisen kautta laboratorioympäristöön.Kokeita suoritettaessa voidaan ryhtyä toimenpiteisiin reagenssien, laboratoriolaitteiden ja pöytätilan saastumisen välttämiseksi, koska tällainen kontaminaatio voi tuottaa vääriä positiivisia (tai vääriä negatiivisia) tuloksia.

Kontaminaation todennäköisyyden vähentämiseksi on aina noudatettava hyvää laboratoriokäytäntöä.Varotoimenpiteitä on ryhdyttävä erityisesti seuraaviin kohtiin:

1. Reagenssien käsittely
2. Työtilan ja laitteiden järjestäminen
3. Käyttö- ja puhdistusohjeet määrätylle molekyylitilalle
4. Yleiset molekyylibiologian neuvot
5. Sisäiset hallintalaitteet
6. Bibliografia

1. Reagenssien käsittely

Sentrifugoi reagenssiputkia lyhyesti ennen avaamista aerosolien muodostumisen välttämiseksi.Jaa reagenssit eriin, jotta vältetään useat jäädytykset ja sulatukset ja päävarastojen saastuminen.Merkitse ja päivämäärä selvästi kaikki reagenssi- ja reaktioputket ja pidä kirjaa kaikissa kokeissa käytetyistä reagenssieristä ja eränumeroista.Pipetoi kaikki reagenssit ja näytteet suodatinkärkillä.Ennen ostamista on suositeltavaa varmistaa valmistajalta, että suodattimen kärjet sopivat käytettävän pipetin merkkiin.

2. Työtilan ja laitteiden järjestäminen

Työtila tulee järjestää siten, että työn virtaus tapahtuu yhteen suuntaan puhtailta alueilta (ennen PCR) likaisiin alueisiin (post-PCR).Seuraavat yleiset varotoimet auttavat vähentämään kontaminaatioriskiä.Järjestä erilliset huoneet tai vähintään fyysisesti erilliset alueet: mastermix-valmistetta, nukleiinihappojen uuttamista ja DNA-templaatin lisäämistä, monistetun tuotteen monistamista ja käsittelyä sekä tuoteanalyysiä, esim. geelielektroforeesia, varten.

Joissakin ympäristöissä 4 erillisen huoneen omistaminen on vaikeaa.Mahdollinen, mutta vähemmän toivottava vaihtoehto on tehdä mastermix-valmistelu suoja-alueella, esim. laminaarivirtauskaappissa.Jos kyseessä on sisäkkäinen PCR-monistus, mastermix-valmistelu toisen kierroksen reaktiota varten tulee valmistaa "puhtaalla" alueella mastermix-valmistelua varten, mutta inokulaatio primaarisella PCR-tuotteella tulee tehdä monistushuoneessa ja jos mahdollista. erityisellä suoja-alueella (esim. laminaarivirtauskaappi).

Jokainen huone/alue tarvitsee erillisen sarjan selkeästi merkittyjä pipettejä, suodatinkärkiä, putkitelineitä, pyörteitä, sentrifugeja (tarvittaessa), kyniä, yleisiä laboratorioreagensseja, laboratoriotakkeja ja käsinelaatikoita, jotka säilyvät vastaavilla työasemilla.Kädet on pestävä ja käsineet ja laboratoriotakit vaihdettava siirryttäessä määrättyjen alueiden välillä.Reagensseja ja laitteita ei saa siirtää likaisesta alueesta puhtaalle alueelle.Jos tapahtuu ääritapaus, jossa reagenssia tai laitetta on siirrettävä taaksepäin, se on ensin dekontaminoitava 10-prosenttisella natriumhypokloriitilla ja pyyhittävä sen jälkeen steriilillä vedellä.

Huomautus

10 % natriumhypokloriittiliuos on täytettävä päivittäin.Kun sitä käytetään dekontaminaatioon, vähintään 10 minuutin kosketusaikaa tulee noudattaa.
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kaupallisesti saatavia tuotteita, jotka on validoitu DNA:ta tuhoaviksi pintadekontaminanteiksi, jos paikalliset turvallisuussuositukset eivät salli natriumhypokloriitin käyttöä tai jos natriumhypokloriitti ei sovellu laitteiden metalliosien puhdistamiseen.

Ihannetapauksessa henkilöstön tulisi noudattaa yksisuuntaista työnkulkua eikä mennä likaisista alueista (PCR:n jälkeen) takaisin puhtaille alueille (pre-PCR) samana päivänä.Saattaa kuitenkin olla tilanteita, jolloin tämä on väistämätöntä.Kun tällainen tilaisuus ilmenee, henkilöstön on huolehdittava siitä, että he pesevät kädet perusteellisesti, vaihtavat käsineet, käyttävät määrättyä laboratoriotakkia ja eivät ota käyttöön mitään välineitä, joita he haluavat viedä pois huoneesta, kuten laboratoriokirjoja.Tällaisia ​​valvontatoimenpiteitä tulisi painottaa henkilöstön koulutuksessa molekyylimenetelmistä.

Käytön jälkeen pöytätilat tulee puhdistaa 10-prosenttisella natriumhypokloriitilla (sen jälkeen steriilillä vedellä valkaisujäämien poistamiseksi), 70-prosenttisella etanolilla tai validoidulla kaupallisesti saatavalla DNA:ta tuhoavalla dekontaminantilla.Ihannetapauksessa ultraviolettilamput (UV-lamput) tulisi asentaa, jotta ne voidaan puhdistaa säteilyttämällä.UV-lamppujen käyttö tulisi kuitenkin rajoittaa suljetuille työskentelyalueille, esim. turvakaapeille, jotta laboratorion henkilökunnan UV-altistus rajoitetaan.Noudata valmistajan ohjeita UV-lamppujen hoidosta, tuuletuksesta ja puhdistuksesta, jotta lamput pysyvät tehokkaina.

Jos natriumhypokloriitin sijasta käytetään 70 % etanolia, dekontaminoinnin loppuun saattamiseksi tarvitaan UV-säteilytys.
Älä puhdista pyörrettä ja sentrifugia natriumhypokloriitilla;pyyhi sen sijaan 70-prosenttisella etanolilla ja altista UV-valolle tai käytä kaupallista DNA:ta tuhoavaa dekontaminointiainetta.Tarkista vuotojen varalta valmistajalta lisätietoja puhdistusohjeista.Jos valmistajan ohjeet sallivat, pipetit on steriloitava rutiininomaisesti autoklaavissa.Jos pipettejä ei voida autoklavoida, riittää niiden puhdistaminen 10-prosenttisella natriumhypokloriitilla (sen jälkeen pyyhitään perusteellisesti steriilillä vedellä) tai kaupallisella DNA:ta tuhoavalla dekontaminointiaineella ja sen jälkeen UV-säteilyllä.

Puhdistus korkea-prosenttisella natriumhypokloriitilla voi lopulta vahingoittaa pipetin muovia ja metalleja, jos se tehdään säännöllisesti;tarkista ensin valmistajan suositukset.Kaikki laitteet on kalibroitava säännöllisesti valmistajan suositteleman aikataulun mukaisesti.Nimetyn henkilön tulee olla vastuussa siitä, että kalibrointiaikataulua noudatetaan, yksityiskohtaisia ​​lokeja ylläpidetään ja huoltotarrat näkyvät selkeästi laitteessa.

3. Käyttö- ja puhdistusohjeet määrätylle molekyylitilalle

Esi-PCR: Reagenssien alikvootointi / Mastermix-valmistelu: Tämän tulee olla puhtain kaikista molekyylikokeiden valmistukseen käytetyistä tiloista, ja ihannetapauksessa sen tulisi olla nimetty laminaarivirtauskaappi, joka on varustettu UV-valolla.Näytteitä, uutettua nukleiinihappoa ja monistettuja PCR-tuotteita ei saa käsitellä tällä alueella.Monistusreagenssit tulee säilyttää pakastimessa (tai jääkaapissa valmistajan suositusten mukaisesti) samassa määrätyssä tilassa, mieluiten laminaarivirtauskaapin tai esi-PCR-alueen vieressä.Käsineet on vaihdettava joka kerta, kun saavut PCR-alueelle tai laminaarivirtauskaappiin.

Esi-PCR-alue tai laminaarivirtauskaappi tulee puhdistaa ennen käyttöä ja käytön jälkeen seuraavasti: Pyyhi kaikki kaapissa olevat esineet, esim. pipetit, kärkilaatikot, vortex, sentrifugi, putkitelineet, kynät jne. 70 % etanolilla tai kaupallinen DNA:ta tuhoava dekontaminointiaine ja anna kuivua.Jos kyseessä on suljettu työskentelyalue, esim. laminaarivirtauskaappi, altista liesituuletin UV-valolle 30 minuutiksi.

Huomautus

Älä altista reagensseja UV-valolle;siirrä ne kaappiin vasta kun se on puhdas.Jos suoritat käänteistranskriptio-PCR:ää, voi myös olla hyödyllistä pyyhkiä pinnat ja laitteet liuoksella, joka hajottaa RNaasit kosketuksessa.Tämä voi auttaa välttämään vääriä negatiivisia tuloksia RNA:n entsyymihajoamisesta.Dekontaminoinnin jälkeen ja ennen mastermixin valmistamista käsineet on vaihdettava vielä kerran, ja sitten kaappi on käyttövalmis.

Pre-PCR: Nukleiinihappouutto/templaatin lisäys:

Nukleiinihappo on uutettava ja käsiteltävä toisella määrätyllä alueella käyttämällä erillistä pipettisarjaa, suodatinkärkiä, putkitelineitä, tuoreita käsineitä, laboratoriotakkeja ja muita välineitä. Tämä alue on tarkoitettu myös mallien, säätimien ja suuntaviivojen lisäämistä varten mastermix-putkia tai -levyjä.Analysoitavien uutettujen nukleiinihapponäytteiden kontaminoitumisen välttämiseksi on suositeltavaa vaihtaa käsineet ennen positiivisten kontrollien tai standardien käsittelyä ja käyttää erillistä pipettisarjaa.PCR-reagensseja ja monistettuja tuotteita ei saa pipetoida tälle alueelle.Näytteet tulee säilyttää määrätyissä jääkaapissa tai pakastimessa samalla alueella.Näytetyötila tulee puhdistaa samalla tavalla kuin mastermix-tila.

Post-PCR: Monistetun tuotteen monistus ja käsittely

Tämä tila on tarkoitettu monistuksen jälkeisille prosesseille, ja sen tulisi olla fyysisesti erillään PCR:ää edeltävistä alueista.Se sisältää yleensä lämpösyklilaitteita ja reaaliaikaisia ​​alustoja, ja ihanteellisesti siinä pitäisi olla laminaarivirtauskaappi kierroksen 1 PCR-tuotteen lisäämiseksi kierroksen 2 reaktioon, jos sisäkkäistä PCR:ää suoritetaan.PCR-reagensseja ja uutettua nukleiinihappoa ei saa käsitellä tällä alueella, koska kontaminaatioriski on suuri.Tällä alueella tulee olla erillinen sarja käsineitä, laboratoriotakkeja, lautas- ja putkitelineitä, pipettejä, suodatinkärkiä, astioita ja muita laitteita.Putket on sentrifugoitava ennen avaamista.Näytetyötila tulee puhdistaa samalla tavalla kuin mastermix-tila.

Post-PCR: Tuoteanalyysi

Tämä huone on tarkoitettu tuotteiden havaitsemislaitteille, esim. geelielektroforeesisäiliöille, tehopakkauksille, UV-transilluminaattorille ja geelidokumentaatiojärjestelmälle.Tällä alueella tulee olla erilliset sarjat käsineitä, laboratoriotakkeja, levy- ja putkitelineitä, pipettejä, suodatinkärkiä, astioita ja muita laitteita.Tälle alueelle ei voida tuoda muita reagensseja, lukuun ottamatta latausväriä, molekyylimarkkeria ja agaroosigeeliä ja puskurikomponentteja.Näytetyötila tulee puhdistaa samalla tavalla kuin mastermix-tila.

Tärkeä muistiinpano

Ihannetapauksessa PCR:ää edeltäviin huoneisiin ei tulisi mennä samana päivänä, jos työ on jo tehty PCR:n jälkeisissä huoneissa.Jos tämä on täysin väistämätöntä, varmista, että kädet pestään ensin perusteellisesti ja että huoneissa käytetään tiettyjä laboratoriotakkeja.Laboratoriokirjoja ja papereita ei saa viedä PCR:tä edeltäviin huoneisiin, jos niitä on käytetty PCR:n jälkeisissä huoneissa;ota tarvittaessa kopioita protokollista/näytetunnuksista jne.

4. Yleiset molekyylibiologian neuvot

Käytä jauhettomia käsineitä välttääksesi määrityksen eston.Oikea pipetointitekniikka on ensiarvoisen tärkeää kontaminaation vähentämisessä.Väärä pipetointi voi aiheuttaa roiskeita nesteitä annostettaessa ja aerosolien muodostumista.Hyviä käytäntöjä oikeaan pipetointiin löydät seuraavista linkeistä: Gilson pipetointiopas, Anachemin pipetointitekniikkavideot, Sentrifugiputket ennen avaamista ja avaa ne varovasti roiskeilta välttääksesi.Sulje putket välittömästi käytön jälkeen välttääksesi epäpuhtauksien pääsyn sisään.

Kun suoritat useita reaktioita, valmista yksi mastermix, joka sisältää tavallisia reagensseja (esim. vettä, dNTP:itä, puskuria, alukkeita ja entsyymiä), jotta reagenssien siirtomäärät ovat mahdollisimman vähäisiä ja kontaminaatioriski vähenee.Mastermix on suositeltavaa asentaa jäälle tai kylmälevylle.Hot Start -entsyymin käyttö voi auttaa vähentämään epäspesifisten tuotteiden tuotantoa.Suojaa fluoresoivia koettimia sisältävät reagenssit valolta hajoamisen välttämiseksi.

5. Sisäiset hallintalaitteet

Sisällytä hyvin karakterisoidut, vahvistetut positiiviset ja negatiiviset kontrollit sekä malliton kontrolli kaikissa reaktioissa ja monipisteinen titrattu trendiviiva kvantitatiivisille reaktioille.Positiivinen kontrolli ei saa olla niin vahva, että se aiheuttaa kontaminaatioriskin.Sisällytä positiiviset ja negatiiviset uuttokontrollit suorittaessasi nukleiinihappouuttoa.

On suositeltavaa, että jokaiselle alueelle asetetaan selkeät ohjeet, jotta käyttäjät ovat tietoisia käyttäytymissäännöistä.Diagnostiset laboratoriot, jotka havaitsevat erittäin alhaisia ​​DNA- tai RNA-tasoja kliinisistä näytteistä, saattavat haluta ottaa käyttöön lisäturvatoimenpidettä eli erilliset ilmankäsittelyjärjestelmät, joissa on hieman positiivinen ilmanpaine PCR-a edeltävissä huoneissa ja lievästi negatiivinen ilmanpaine PCR:n jälkeisissä huoneissa.

Lopuksi laadunvarmistussuunnitelman (QA) kehittäminen on hyödyllistä.Tällaiseen suunnitelmaan tulisi sisältyä luettelot reagenssien päävarastoista ja käyttövarastoista, sarjojen ja reagenssien varastointisäännöt, valvontatulosten raportointi, henkilöstön koulutusohjelmat, vianetsintäalgoritmit ja tarvittaessa korjaavat toimet.

6. Bibliografia

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Luku 3: QPCR-laboratorion perustaminen.Ohjeasiakirja virkistysvesien testaamiseen USEPA qPCR -menetelmällä 1611. Lansing-Michigan State University.

Englannin kansanterveys, NHS.Yhdistyneen kuningaskunnan standardit mikrobiologisille tutkimuksille: Hyvä laboratoriokäytäntö molekyylien monistusmäärityksiä suoritettaessa).Laatuopastus.2013; 4(4):1–15.

Mifflin T. PCR-laboratorion perustaminen.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Sentrifugien rutiinihuolto: sentrifugien, roottoreiden ja adapterien puhdistus, huolto ja desinfiointi (Valkoinen paperi nro 14).Hampuri: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) diagnostisissa laboratorioissa käytettäviä molekyylipohjaisia ​​testejä varten, julkaisussa: Akyar I, toimittaja.Laaja valikoima laadunvalvontaa.Rijeka, Kroatia: Intech;2011: 29–52.