روش‌های تشخیص مولکولی توانایی تولید حجم زیادی از اسید نوکلئیک را از طریق تقویت مقادیر کمیاب موجود در نمونه‌ها دارند.در حالی که این برای فعال کردن تشخیص حساس مفید است، امکان آلودگی را از طریق پخش آئروسل های تقویت کننده در محیط آزمایشگاه نیز معرفی می کند.هنگام انجام آزمایش ها، می توان اقداماتی را برای جلوگیری از آلودگی معرف ها، تجهیزات آزمایشگاهی و فضای نیمکت انجام داد، زیرا چنین آلودگی ممکن است نتایج مثبت کاذب (یا منفی کاذب) ایجاد کند.

برای کمک به کاهش احتمال آلودگی، تمرین خوب آزمایشگاهی باید همیشه انجام شود.به طور خاص، در مورد نکات زیر باید اقدامات احتیاطی انجام شود:

1. جابجایی معرف ها
2. سازماندهی فضای کار و تجهیزات
3. توصیه استفاده و تمیز کردن فضای مولکولی تعیین شده
4. مشاوره عمومی زیست شناسی مولکولی
5. کنترل های داخلی
6. کتابشناسی

1. جابجایی معرف ها

لوله های معرف را قبل از باز کردن به طور خلاصه سانتریفیوژ کنید تا از تولید آئروسل جلوگیری شود.معرفهای Aliquot برای جلوگیری از انجماد و ذوب های متعدد و آلودگی ذخایر اصلی.تمام لوله‌های معرف و واکنش را به‌روشنی برچسب‌گذاری کنید و تاریخ‌گذاری کنید و گزارش‌های مربوط به تعداد معرف‌ها و شماره‌های دسته‌ای که در همه آزمایش‌ها استفاده می‌شوند را حفظ کنید.تمام معرف ها و نمونه ها را با استفاده از نوک فیلتر پیپت کنید.قبل از خرید، توصیه می شود با سازنده تأیید کنید که نوک فیلتر مطابق با مارک پیپت مورد استفاده است.

2. سازماندهی فضای کار و تجهیزات

فضای کاری باید طوری سازماندهی شود که جریان کار در یک جهت انجام شود، از مناطق تمیز (پیش از PCR) تا مناطق کثیف (پس از PCR).اقدامات احتیاطی کلی زیر به کاهش احتمال آلودگی کمک می کند.اتاق‌های مشخص شده جداگانه یا حداقل مناطق مجزا از لحاظ فیزیکی داشته باشید، برای: آماده‌سازی مستر میکس، استخراج اسید نوکلئیک و افزودن الگوی DNA، تقویت و جابجایی محصول تقویت‌شده، و آنالیز محصول، به‌عنوان مثال الکتروفورز ژل.

در برخی تنظیمات، داشتن 4 اتاق مجزا دشوار است.یک گزینه ممکن اما کمتر مطلوب این است که آماده سازی مسترمیکس را در یک منطقه محفظه انجام دهید، به عنوان مثال یک کابینت جریان آرام.در مورد تقویت PCR تو در تو، آماده سازی ماست میکس برای واکنش دور دوم باید در منطقه "تمیز" برای آماده سازی مسترمیکس آماده شود، اما تلقیح با محصول اولیه PCR باید در اتاق تقویت و در صورت امکان انجام شود. در یک منطقه نگهداری اختصاصی (به عنوان مثال یک کابین جریان آرام).

هر اتاق/منطقه به مجموعه جداگانه‌ای از پیپت‌ها، نوک فیلتر، قفسه‌های لوله، گرداب‌ها، سانتریفیوژها (در صورت لزوم)، قلم‌ها، معرف‌های آزمایشگاهی عمومی، روکش‌های آزمایشگاهی و جعبه‌های دستکش نیاز دارد که در ایستگاه‌های کاری مربوطه باقی می‌مانند.هنگام حرکت بین مناطق تعیین شده، دست ها باید شسته شوند و دستکش ها و روپوش های آزمایشگاهی تعویض شوند.معرف ها و تجهیزات نباید از یک منطقه کثیف به یک منطقه تمیز منتقل شوند.در صورت بروز یک مورد شدید که در آن معرف یا قطعه ای از تجهیزات باید به عقب جابجا شود، ابتدا باید با هیپوکلریت سدیم 10 درصد ضدعفونی شود و سپس با آب استریل پاک شود.

توجه داشته باشید

محلول هیپوکلریت سدیم 10 درصد باید روزانه تازه تهیه شود.هنگام استفاده برای ضدعفونی کردن، حداقل زمان تماس 10 دقیقه باید رعایت شود.
از طرف دیگر، اگر توصیه‌های ایمنی محلی اجازه استفاده از هیپوکلریت سدیم را نمی‌دهد یا اگر هیپوکلریت سدیم برای ضدعفونی‌کردن قطعات فلزی تجهیزات مناسب نباشد، می‌توان از محصولات موجود تجاری که به‌عنوان ضدعفونی‌کننده‌های سطحی تخریب‌کننده DNA تأیید شده‌اند، استفاده کرد.

در حالت ایده‌آل، کارکنان باید اصول جریان کار یک طرفه را رعایت کنند و در همان روز از مناطق کثیف (پس از PCR) به مناطق تمیز (قبل از PCR) برنگردند.با این حال، ممکن است مواردی وجود داشته باشد که این امر اجتناب ناپذیر باشد.هنگامی که چنین موقعیتی پیش می آید، پرسنل باید مراقب باشند که دست ها را کاملا بشویند، دستکش ها را عوض کنند، از روپوش آزمایشگاهی تعیین شده استفاده کنند و هیچ وسیله ای را که می خواهند دوباره از اتاق خارج کنند، مانند کتاب های آزمایشگاهی، معرفی نکنند.چنین اقدامات کنترلی باید در آموزش کارکنان در مورد روش های مولکولی تاکید شود.

پس از استفاده، فضاهای نیمکت ها باید با 10% هیپوکلریت سدیم (به دنبال آن آب استریل برای حذف سفید کننده های باقیمانده)، اتانول 70% یا یک ضدعفونی کننده تخریب کننده DNA معتبر تجاری موجود تمیز شود.در حالت ایده‌آل، لامپ‌های فرابنفش (UV) باید نصب شوند تا آلودگی‌زدایی با تابش را امکان‌پذیر کنند.با این حال، استفاده از لامپ های UV باید به مناطق بسته کاری محدود شود، به عنوان مثال کابینت های ایمنی، به منظور محدود کردن قرار گرفتن در معرض اشعه ماوراء بنفش کارکنان آزمایشگاه.لطفاً دستورالعمل‌های سازنده را برای مراقبت، تهویه و تمیز کردن لامپ UV رعایت کنید تا مطمئن شوید که لامپ‌ها موثر باقی می‌مانند.

در صورت استفاده از اتانول 70% به جای هیپوکلریت سدیم، تابش اشعه ماوراء بنفش برای کامل کردن آلودگی مورد نیاز خواهد بود.
گرداب و سانتریفیوژ را با هیپوکلریت سدیم تمیز نکنید.در عوض، با اتانول 70 درصد پاک کنید و در معرض اشعه ماوراء بنفش قرار دهید یا از یک ضدعفونی کننده تجاری تخریب کننده DNA استفاده کنید.برای نشت، برای مشاوره بیشتر در مورد تمیز کردن با سازنده تماس بگیرید.اگر دستورالعمل های سازنده اجازه می دهد، پیپت ها باید به طور معمول توسط اتوکلاو استریل شوند.اگر پیپت‌ها را نمی‌توان اتوکلاو کرد، باید آن‌ها را با هیپوکلریت سدیم 10 درصد (به دنبال پاک کردن کامل با آب استریل) یا با یک ضدعفونی‌کننده تجاری تخریب‌کننده DNA و به دنبال آن در معرض اشعه ماوراء بنفش تمیز کرد.

تمیز کردن با هیپوکلریت سدیم با درصد بالا ممکن است در نهایت به پلاستیک و فلزات پیپت آسیب برساند، اگر به طور منظم انجام شود.ابتدا توصیه های سازنده را بررسی کنید.همه تجهیزات باید به طور منظم طبق برنامه زمانی توصیه شده توسط سازنده کالیبره شوند.یک شخص تعیین شده باید مسئول اطمینان از رعایت برنامه کالیبراسیون، حفظ گزارش های دقیق و نمایش برچسب های خدمات به وضوح بر روی تجهیزات باشد.

3. توصیه استفاده و تمیز کردن فضای مولکولی تعیین شده

Pre-PCR: جداسازی معرف / آماده سازی مستتر میکس: این باید تمیزترین فضا در بین تمام فضاهای مورد استفاده برای آماده سازی آزمایشات مولکولی باشد و در حالت ایده آل باید یک کابینت جریان آرام تعیین شده مجهز به نور UV باشد.نمونه ها، اسید نوکلئیک استخراج شده و محصولات تقویت شده PCR نباید در این ناحیه مورد استفاده قرار گیرند.معرف های تقویت کننده باید در یک فریزر (یا یخچال، طبق توصیه های سازنده) در همان فضای تعیین شده، به طور ایده آل در کنار کابینت جریان آرام یا منطقه قبل از PCR نگهداری شوند.دستکش ها باید هر بار پس از ورود به قسمت قبل از PCR یا کابین جریان آرام تعویض شوند.

ناحیه Pre-PCR یا کابین جریان لامینار باید قبل و بعد از استفاده به شرح زیر تمیز شود: تمام موارد داخل کابینت مانند پیپت ها، جعبه های نوک، گرداب، سانتریفیوژ، قفسه های لوله، قلم ها و غیره را با اتانول 70 درصد پاک کنید. ضدعفونی کننده تجاری تخریب کننده DNA و اجازه دهید خشک شود.در مورد یک منطقه کاری بسته، به عنوان مثال یک کابین جریان آرام، هود را به مدت 30 دقیقه در معرض نور UV قرار دهید.

توجه داشته باشید

معرف ها را در معرض نور UV قرار ندهید.فقط زمانی که کابینت تمیز شد آنها را به داخل کابینت منتقل کنید.در صورت انجام PCR رونویسی معکوس، پاک کردن سطوح و تجهیزات با محلولی که RNase ها را در تماس می شکند، ممکن است مفید باشد.این ممکن است به جلوگیری از نتایج منفی کاذب ناشی از تخریب آنزیم RNA کمک کند.پس از رفع آلودگی و قبل از تهیه مسترمیکس، دستکش باید یک بار دیگر تعویض شود و سپس کابینت آماده استفاده است.

Pre-PCR: استخراج/افزودن قالب اسید نوکلئیک:

اسید نوکلئیک باید در یک منطقه تعیین‌شده دوم، با استفاده از مجموعه جداگانه‌ای از پیپت‌ها، نوک‌های فیلتر، قفسه‌های لوله، دستکش‌های تازه، روکش‌های آزمایشگاهی و سایر تجهیزات استخراج و کار شود. این منطقه همچنین برای افزودن الگو، کنترل‌ها و خطوط روند به لوله ها یا صفحات مستر میکس.برای جلوگیری از آلودگی نمونه‌های اسید نوکلئیک استخراج‌شده که در حال تجزیه و تحلیل هستند، توصیه می‌شود قبل از دست زدن به کنترل‌ها یا استانداردهای مثبت دستکش را تعویض کنید و از مجموعه جداگانه‌ای از پیپت‌ها استفاده کنید.معرف های PCR و محصولات تقویت شده نباید در این ناحیه پیپت شوند.نمونه ها باید در یخچال یا فریزرهای مشخص در همان منطقه نگهداری شوند.فضای کار نمونه باید به همان روشی که فضای مستر میکس تمیز شود.

Post-PCR: تقویت و جابجایی محصول تقویت شده

این فضای تعیین شده برای فرآیندهای پس از تقویت است و باید از نظر فیزیکی از مناطق قبل از PCR جدا باشد.معمولاً حاوی ترموسایکلرها و پلتفرم‌های بلادرنگ است و در حالت ایده‌آل باید یک کابینت جریان آرام برای افزودن محصول دور 1 PCR به واکنش دور دوم داشته باشد، اگر PCR تودرتو انجام می‌شود.معرف های PCR و اسید نوکلئیک استخراج شده نباید در این منطقه استفاده شوند زیرا خطر آلودگی زیاد است.این قسمت باید مجموعه ای جداگانه از دستکش، روکش آزمایشگاهی، قفسه بشقاب و لوله، پیپت، نوک فیلتر، سطل و سایر تجهیزات داشته باشد.لوله ها باید قبل از باز شدن سانتریفیوژ شوند.فضای کار نمونه باید به همان روشی که فضای مستر میکس تمیز شود.

پس از PCR: تجزیه و تحلیل محصول

این اتاق برای تجهیزات تشخیص محصول، به عنوان مثال مخازن الکتروفورز ژل، بسته های برق، ترانسیلومیاتور UV و سیستم اسناد ژل است.این قسمت باید مجموعه های جداگانه ای از دستکش ها، روکش های آزمایشگاهی، قفسه های بشقاب و لوله، پیپت، نوک فیلتر، سطل و سایر تجهیزات داشته باشد.هیچ معرف دیگری به جز رنگ بارگذاری، نشانگر مولکولی و ژل آگارز و اجزای بافر نمی تواند وارد این منطقه شود.فضای کار نمونه باید به همان روشی که فضای مستر میکس تمیز شود.

یادداشت مهم

در حالت ایده آل، اتاق های قبل از PCR نباید در همان روز وارد شوند، اگر کار قبلاً در اتاق های پس از PCR انجام شده باشد.اگر این امر کاملاً اجتناب ناپذیر است، اطمینان حاصل کنید که ابتدا دست ها به طور کامل شسته شده و کت های آزمایشگاهی خاصی در اتاق ها پوشیده شده است.اگر در اتاق‌های بعد از PCR استفاده شده باشد، کتاب‌ها و اسناد آزمایشگاهی نباید به اتاق‌های قبل از PCR برده شوند.در صورت لزوم، پرینت های تکراری از پروتکل ها/شناسه های نمونه و غیره بگیرید.

4. مشاوره عمومی زیست شناسی مولکولی

برای جلوگیری از مهار آزمایش از دستکش های بدون پودر استفاده کنید.روش صحیح پیپتینگ برای کاهش آلودگی بسیار مهم است.لوله گذاری نادرست می تواند منجر به پاشیدن مایعات و ایجاد ذرات معلق در هوا شود.روش خوب برای پیپت کردن صحیح را می توانید در پیوندهای زیر بیابید: راهنمای Gilson برای پیپت کردن، ویدیوهای تکنیک پیپت کردن Anachem، لوله ها را قبل از باز کردن سانتریفیوژ کنید و برای جلوگیری از پاشش آنها را با دقت باز کنید.لوله ها را بلافاصله پس از استفاده ببندید تا از ورود آلاینده ها جلوگیری شود.

هنگام انجام چندین واکنش، یک مستتر میکس حاوی معرف های رایج (مانند آب، dNTPs، بافر، پرایمرها و آنزیم) آماده کنید تا تعداد انتقال معرف به حداقل برسد و خطر آلودگی کاهش یابد.توصیه می شود مستر میکس را روی یخ یا بلوک سرد تنظیم کنید.استفاده از آنزیم شروع داغ ممکن است به کاهش تولید محصولات غیر اختصاصی کمک کند.معرف های حاوی پروب های فلورسنت را از نور محافظت کنید تا از تخریب جلوگیری شود.

5. کنترل های داخلی

شامل کنترل های مثبت و منفی با مشخصه، تایید شده، همراه با کنترل بدون الگو در همه واکنش ها، و خط روند تیتر شده چند نقطه ای برای واکنش های کمی است.کنترل مثبت نباید آنقدر قوی باشد که خطر آلودگی ایجاد کند.هنگام انجام استخراج اسید نوکلئیک، کنترل های استخراج مثبت و منفی را در نظر بگیرید.

توصیه می شود دستورالعمل های واضحی در هر یک از حوزه ها درج شود تا کاربران از قوانین رفتاری آگاه شوند.آزمایشگاه‌های تشخیصی که سطوح بسیار پایین DNA یا RNA را در نمونه‌های بالینی تشخیص می‌دهند، ممکن است بخواهند از معیار امنیتی اضافی استفاده کنند که سیستم‌های انتقال هوای مجزا با فشار هوا کمی مثبت در اتاق‌های قبل از PCR و فشار هوا کمی منفی در اتاق‌های پس از PCR دارند.

در نهایت، توسعه یک طرح تضمین کیفیت (QA) مفید است.چنین طرحی باید شامل فهرستی از ذخایر اصلی معرف و ذخایر فعال، قوانین ذخیره سازی کیت ها و معرف ها، گزارش نتایج کنترل، برنامه های آموزشی کارکنان، الگوریتم های عیب یابی و اقدامات اصلاحی در صورت نیاز باشد.

6. کتابشناسی

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. فصل 3: راه اندازی یک آزمایشگاه qPCR.یک سند راهنمایی برای آزمایش آبهای تفریحی با استفاده از روش USEPA qPCR 1611. Lansing- University State Michigan.

بهداشت عمومی انگلستان، NHS.استانداردهای انگلستان برای تحقیقات میکروبیولوژی: عملکرد خوب آزمایشگاهی هنگام انجام سنجش‌های تقویت مولکولی).راهنمای کیفیت.2013؛ 4 (4): 1-15.

Mifflin T. راه اندازی آزمایشگاه PCR.Cold Spring Harb Protoc.2007؛ 7.

Schroeder S 2013. تعمیر و نگهداری معمولی سانتریفیوژها: تمیز کردن، نگهداری و ضدعفونی سانتریفیوژها، روتورها و آداپتورها (کاغذ سفید شماره 14).هامبورگ: اپندورف;2013.

Viana RV، Wallis CL.عملکرد آزمایشگاهی خوب بالینی (GCLP) برای آزمایش‌های مبتنی بر مولکولی مورد استفاده در آزمایشگاه‌های تشخیصی، در: Akyar I، ویراستار.طیف گسترده ای از کنترل کیفیت.Rijeka، کرواسی: Intech;2011: 29-52.