Detekzio molekularren metodoek azido nukleiko bolumen handia ekoizteko gaitasuna dute laginetan aurkitutako arrasto-kantitateen anplifikazioaren bidez.Hau detekzio sentikorra ahalbidetzeko onuragarria den arren, kutsatzeko aukera ere sartzen du laborategiko ingurunean anplifikazio aerosolak hedatzearen bidez.Esperimentuak egiterakoan, neurriak har daitezke erreaktiboak, laborategiko ekipoak eta bankuko espazioa kutsatzea saihesteko, kutsadura horrek emaitza faltsu-positiboak (edo faltsu-negatiboak) sor ditzakeelako.

Kutsaduraren probabilitatea murrizten laguntzeko, Laborategiko Praktika Egokiak erabili behar dira uneoro.Zehazki, neurri hauek hartu behar dira puntu hauen inguruan:

1. Erreaktiboak maneiatzea
2. Lan-esparruaren eta ekipamenduaren antolaketa
3. Izendatutako espazio molekularra erabiltzeko eta garbitzeko aholkuak
4. Biologia molekularrari buruzko aholku orokorrak
5. Barne kontrolak
6. Bibliografia

1. Erreaktiboak maneiatzea

Labur zentrifugatu erreaktiboen hodiak ireki aurretik, aerosolak sortzea saihesteko.Erreaktibo alikuotak izozte-desizozte anitz eta stock nagusien kutsadura saihesteko.Argi eta garbi etiketatu eta datatu erreaktibo eta erreakzio-hodi guztiak eta mantendu esperimentu guztietan erabilitako erreaktiboen lote eta lote-zenbakien erregistroak.Pipetatu erreaktibo eta lagin guztiak iragazki-puntak erabiliz.Erosi aurretik, komeni da fabrikatzailearekin berrestea iragazki-puntak erabili beharreko pipeta-markarekin bat datozela.

2. Lan-esparruaren eta ekipamenduaren antolaketa

Lan-espazioa antolatu behar da lan-fluxua norabide bakarrean gertatzen dela ziurtatzeko, gune garbietatik (PCR aurrekoa) gune zikinetara (PCR osteko).Ondorengo neurri orokor hauek kutsatzeko aukera murrizten lagunduko dute.Gela bereiziak izan, edo, gutxienez, fisikoki bereiziak, hauek egiteko: mastermix prestatzeko, azido nukleikoen erauzketa eta DNA txantiloia gehitzeko, anplifikatutako produktua anplifikatzeko eta manipulatzeko, eta produktuaren analisia, adibidez, gel elektroforesia.

Zenbait ezarpenetan, zaila da 4 gela bereizi izatea.Aukera posible, baina ez hain desiragarria, mastermixaren prestaketa edukiontzi-eremu batean egitea da, adibidez, fluxu laminarreko armairu batean.PCR anplifikazio habiatuaren kasuan, bigarren txandako erreakziorako mastermixaren prestaketa mastermix prestatzeko eremu "garbian" prestatu behar da, baina PCR produktu primarioarekin inokulazioa anplifikazio gelan egin behar da, eta ahal bada. atxikipen-eremu propio batean (adibidez, fluxu laminarreko armairu batean).

Gela/eremu bakoitzak argi eta garbi etiketatutako pipeta, iragazki-puntak, hodi-erretxeak, zurrunbiloak, zentrifugatzaileak (hala badagokio), boligrafoak, laborategiko erreaktibo generikoak, laborategiko berokiak eta eskularru-kutxak behar ditu, dagozkien lantokian geratuko direnak.Eskuak garbitu eta eskularruak eta laborategiko batak aldatu behar dira izendatutako guneen artean mugitzean.Erreaktiboak eta ekipoak ez dira leku zikin batetik gune garbi batera eraman behar.Erreaktibo edo ekipo bat atzerantz eraman behar den muturreko kasuren bat gertatuz gero, lehenik %10eko sodio hipokloritoarekin deskontaminatu beharko da, eta ondoren ur antzuarekin garbitu behar da.

Ohar

Sodio hipokloritoaren %10eko disoluzioa egunero fresko egin behar da.Deskontaminaziorako erabiltzen denean, gutxienez 10 minutuko kontaktu-denbora bete behar da.
Bestela, DNA suntsitzen duten gainazaleko deskontaminatzaile gisa balioztatutako merkataritzako produktuak erabil daitezke, tokiko segurtasun-gomendioek sodio hipokloritoa erabiltzea onartzen ez badute edo sodio hipokloritoa ekipoen zati metalikoak deskontaminatzeko egokia ez bada.

Egokiena, langileek norabide bakarreko lan-fluxuaren ethosari eutsi behar diote eta ez dute gune zikinetatik (PCR osteko) gune garbietara (PCR aurrekoa) itzuli egun berean.Hala ere, baliteke hori saihestezina den kasuak egon.Halako kasua gertatzen denean, langileek eskuak ondo garbitu, eskularruak aldatu, izendatutako laborategiko bata erabili behar dute eta ez dute berriro gelatik atera nahi duten ekipamendurik sartu, hala nola laborategiko liburuak.Kontrol-neurri horiek metodo molekularrei buruzko langileen prestakuntzan azpimarratu behar dira.

Erabili ondoren, banku-espazioak % 10eko sodio hipokloritoarekin garbitu behar dira (urte esterilarekin, ondoren, lixiba hondarra kentzeko), % 70eko etanolarekin edo merkatuan eskuragarri dagoen DNA suntsitzen duen deskontaminatzaile balioztatu batekin.Egokiena, ultramoreak (UV) lanparak instalatu behar dira irradiazio bidez deskontaminazioa ahalbidetzeko.Hala ere, UV lanparak erabiltzea lan-eremu itxietara mugatu behar da, adibidez, segurtasun-armairuetara, laborategiko langileen UV esposizioa mugatzeko.Mesedez, bete UV lanparak zaintzeko, aireztatzeko eta garbitzeko fabrikatzailearen argibideak, lanparak eraginkorrak izaten jarraitzen dutela ziurtatzeko.

Sodio hipokloritoaren ordez %70eko etanola erabiltzen baduzu, UV argiarekin irradiatzea beharrezkoa izango da deskontaminazioa amaitzeko.
Ez garbitu zurrunbiloa eta zentrifugatu sodio hipokloritoarekin;horren ordez, garbitu %70eko etanolarekin eta jarri UV argira, edo erabili DNA suntsitzen duen deskontaminatzaile komertziala.Isuriak egiteko, egiaztatu fabrikatzailearekin garbiketa-aholku gehiago lortzeko.Fabrikatzailearen argibideek hala baimentzen badute, pipetak autoklabez esterilizatu behar dira.Pipetak ezin badira autoklabetu, nahikoa izango da sodio hipokloritoaren % 10arekin garbitzea (ondoren garbiketa sakon batekin ur esterilaz) edo DNA suntsitzen duen deskontaminatzaile komertzial batekin eta UV esposizioarekin.

Ehuneko handiko sodio hipokloritoarekin garbitzeak pipeta plastikoak eta metalak kaltetu ditzake erregularki egiten bada;egiaztatu lehenik fabrikatzailearen gomendioak.Ekipamendu guztiak aldiro kalibratu behar dira fabrikatzaileak gomendatutako ordutegiaren arabera.Izendatutako pertsona batek arduratu behar du kalibrazio-egutegia betetzen dela, erregistro zehatzak mantentzen direla eta zerbitzu-etiketak ekipoetan argi eta garbi erakusten direla.

3. Izendatutako espazio molekularra erabiltzeko eta garbitzeko aholkuak

Pre-PCR: Erreaktiboen alikuota / mastermix prestatzea: esperimentu molekularrak prestatzeko erabiltzen diren espazio guztietatik garbiena izan behar da eta UV argiz hornitutako fluxu laminarreko kabinete bat izan behar du.Laginak, ateratako azido nukleikoa eta anplifikatutako PCR produktuak ez dira eremu horretan manipulatu behar.Anplifikazio-erreaktiboak izozkailuan (edo hozkailuan, fabrikatzailearen gomendioen arabera) gorde behar dira izendatutako leku berean, hobe da fluxu laminarraren kabinetearen edo PCR aurreko eremuaren ondoan.Eskularruak aldatu behar dira aldi bakoitzean PCR aurreko eremuan edo fluxu laminarreko kabinetean sartzean.

PCR aurreko eremua edo fluxu laminarraren kabinetea garbitu behar da, erabili aurretik eta ondoren, honela: Garbitu armairuko elementu guztiak, adibidez pipetak, punta-kaxak, zurrunbiloa, zentrifugatzailea, hodi-euskarriak, boligrafoak, etab. % 70eko etanolarekin edo DNA suntsitzen duen deskontaminatzaile komertziala eta lehortzen utzi.Lan-eremu itxi baten kasuan, adibidez, fluxu laminarreko armairu bat, jarri kanpaia UV argiaren aurrean 30 minutuz.

Ohar

Ez jarri erreaktiboak UV argira;garbitu ondoren bakarrik eraman itzazu armairura.Alderantzizko transkripzioko PCR egiten baduzu, lagungarria izan daiteke gainazalak eta ekipoak garbitzea kontaktuan RNasak apurtzen dituen irtenbide batekin.Honek RNAren entzimaren degradazioaren emaitza faltsu-negatiboak saihesten lagun dezake.Deskontaminatu ondoren eta mastermix prestatu aurretik, eskularruak berriro aldatu behar dira, eta, ondoren, armairua erabiltzeko prest dago.

Pre-PCR: azido nukleikoen erauzketa/txantiloiaren gehikuntza:

Azido nukleikoa bigarren eremu batean atera eta manipulatu behar da, pipeta, iragazki-puntak, hodi-euskarriak, eskularru freskoak, laborategiko berokiak eta beste ekipo batzuk erabiliz. Eremu hau txantiloi, kontrolak eta joera-lerroak gehitzeko ere bada. mastermix hodiak edo plakak.Aztertzen ari diren ateratako azido nukleikoen laginak kutsatzea saihesteko, kontrol positiboak edo estandarrak manipulatu aurretik eskularruak aldatzea eta pipeta-multzo bereizia erabiltzea gomendatzen da.PCR erreaktiboak eta produktu anplifikatuak ez dira pipeteatu behar eremu honetan.Laginak eremu bereko hozkailu edo izozkailuetan gorde behar dira.Laginaren lan-eremua mastermix-aren modu berean garbitu behar da.

Post-PCR: Anplifikatutako produktuaren anplifikazioa eta manipulazioa

Izendatutako espazio hau anplifikazio osteko prozesuetarako da eta PCR aurreko eremuetatik fisikoki bereizita egon behar du.Termoziklatzaileak eta denbora errealeko plataformak ditu normalean, eta, hobe da, fluxu laminarreko kabinete bat eduki beharko luke 1. biribilduko PCR produktua 2. biribilduko erreakzioari gehitzeko, habiaratutako PCR egiten ari bada.PCR erreaktiboak eta ateratako azido nukleikoa ez dira eremu honetan manipulatu behar kutsatzeko arriskua handia baita.Eremu honek eskularruak, laborategiko batak, plaka eta hodiak, pipetak, iragazki-puntak, ontziak eta bestelako ekipamenduak izan behar ditu.Hodiak zentrifugatu behar dira ireki aurretik.Laginaren lan-eremua mastermix-aren modu berean garbitu behar da.

Post-PCR: Produktuen analisia

Gela hau produktuak detektatzeko ekipamenduetarako da, adibidez, gel elektroforesi tankeak, power pack, UV transiluminadorea eta gelaren dokumentazio sistema.Eremu honek eskularru, laborategiko batak, plater eta hodi-erretxeak, pipetak, iragazki-puntak, ontziak eta bestelako ekipamenduak izan behar ditu.Eremu honetara ezin da beste erreaktiborik sartu, kargatzeko koloratzailea, markatzaile molekularra eta agarosa gela eta buffer osagaiak kenduta.Laginaren lan-eremua mastermix-aren modu berean garbitu behar da.

Ohar garrantzitsua

Egokiena, PCR aurreko geletan ez da egun berean sartu behar PCR osteko geletan lana egin bada.Hori guztiz saihestezina bada, ziurtatu eskuak ondo garbitzen direla lehenik eta geletan laborategiko bata zehatzak eramaten direla.Laborategiko liburuak eta paperak ez dira PCR aurreko geletara eraman behar PCR osteko geletan erabili badira;behar izanez gero, hartu protokoloen/lagin IDen inprimaketa bikoiztuak, etab.

4. Biologia molekularrari buruzko aholku orokorrak

Erabili hautsik gabeko eskularruak saiakuntzaren inhibizioa saihesteko.Pipetatze-teknika zuzena funtsezkoa da kutsadura murrizteko.Okerreko pipetatzeak zipriztinak eragin ditzake likidoak banatzean eta aerosolak sortzea.Pipeteatze zuzena egiteko praktika onak esteka hauetan aurki daitezke: Gilson pipeteatzeko gidaliburua, Anachem pipetting teknikaren bideoak, Zentrifugatutako hodiak ireki aurretik, eta ireki arretaz zipriztinak ekiditeko.Itxi hodiak erabili eta berehala, kutsatzaileak ez sartzeko.

Erreakzio anitz egitean, prestatu mastermix bat erreaktibo arruntak dituena (adibidez, ura, dNTPak, buffer, abiarazleak eta entzima) erreaktiboen transferentzia kopurua minimizatzeko eta kutsaduraren mehatxua murrizteko.Gomendagarria da mastermixa izotzean edo bloke hotz batean ezartzea.Hot Start entzima erabiltzeak produktu ez-espezifikoen ekoizpena murrizten lagun dezake.Babestu zunda fluoreszenteak dituzten erreaktiboak argitik degradatzea ekiditeko.

5. Barne kontrolak

Sartu kontrol positiboak eta negatiboak ongi karakterizatuak, baieztatuak, erreakzio guztietan txantiloirik gabeko kontrol batekin eta erreakzio kuantitatiboetarako puntu anitzeko joera-lerroa.Kontrol positiboa ez da hain indartsua izan behar kutsadura-arrisku bat suposatzen duen.Sartu erauzketa-kontrol positiboak eta negatiboak azido nukleikoen erauzketa egitean.

Eremu bakoitzean argibide argiak jartzea gomendatzen da, erabiltzaileek jokabide-arauen berri izan dezaten.Lagin klinikoetan DNA edo RNA maila oso baxuak detektatzen dituzten diagnostiko-laborategiek segurtasun-neurri osagarria hartu nahi dute PCR aurreko geletan aire-presio apur bat positiboa duten airea kudeatzeko sistema bereiziak eta PCR ondorengo geletan aire-presioa apur bat negatiboa dutenak.

Azkenik, kalitatea bermatzeko (QA) plan bat garatzea lagungarria da.Plan horrek erreaktibo nagusien izakinen eta laneko izakinen zerrendak, kitak eta erreaktiboak gordetzeko arauak, kontrol-emaitzen berri ematea, langileen prestakuntza-programak, arazoak konpontzeko algoritmoak eta konponketa-ekintzak behar direnean barne hartu behar ditu.

6. Bibliografia

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. 3. kapitulua: qPCR laborategi bat konfiguratzea.USEPA qPCR metodoa erabiliz aisialdiko urak probatzeko gida-dokumentua 1611. Lansing- Michigan State University.

Osasun Publikoa Ingalaterra, NHS.Mikrobiologia-ikerketetarako Erresuma Batuko estandarrak: Laborategiko Praktika Onak anplifikazio molekularren saiakuntzak egitean).Kalitate Orientabidea.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. PCR laborategi bat ezartzea.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Zentrifugatzaileen ohiko mantentze-lanak: zentrifugatzaileen, errotoreen eta moldagailuen garbiketa, mantentzea eta desinfekzioa (Liburu Zuria 14. zk.).Hanburgo: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Laborategiko Praktika Kliniko Onak (GCLP) diagnostiko laborategietan erabiltzen diren molekularretan oinarritutako probetarako, In: Akyar I, editorea.Kalitate-kontrolaren espektro zabalak.Rijeka, Kroazia: Intech;2011: 29–52.