Molekulaarsete tuvastamismeetodite abil on võimalik toota suures koguses nukleiinhapet proovides leiduvate jälgede amplifitseerimise kaudu.Kuigi see on kasulik tundliku tuvastamise võimaldamiseks, toob see kaasa ka saastumise võimaluse amplifikatsiooniaerosoolide levimise kaudu laborikeskkonda.Katsete tegemisel võib võtta meetmeid, et vältida reaktiivide, laboriseadmete ja töölaua saastumist, kuna selline saastumine võib anda valepositiivseid (või valenegatiivseid) tulemusi.

Saastumise tõenäosuse vähendamiseks tuleks alati järgida head laboritava.Täpsemalt tuleks ettevaatusabinõusid võtta järgmiste punktide osas:

1. Reaktiivide käsitsemine
2. Tööruumi ja seadmete korraldus
3. Kasutamis- ja puhastusnõuanded määratud molekulaarruumi jaoks
4. Üldised molekulaarbioloogia nõuanded
5. Sisekontroll
6. Bibliograafia

1. Reaktiivide käsitsemine

Enne avamist tsentrifuugige reaktiivitorusid korraks, et vältida aerosoolide teket.Jagage reaktiivid alikvootideks, et vältida korduvat külmutamist-sulatamist ja põhivarude saastumist.Märgistage ja dateerige selgelt kõik reaktiivi- ja reaktsioonituubid ning säilitage kõigis katsetes kasutatud reaktiivipartiide ja partiide numbrite logi.Pipeteerige kõik reaktiivid ja proovid filtriotsikute abil.Enne ostmist on soovitatav tootjaga kontrollida, kas filtriotsad sobivad kasutatava pipeti kaubamärgiga.

2. Tööruumi ja seadmete korraldus

Tööruum tuleks korraldada nii, et töö kulgeks ühes suunas, puhastest aladest (pre-PCR) määrdunud aladeni (post-PCR).Järgmised üldised ettevaatusabinõud aitavad vähendada saastumise võimalust.Omama eraldi määratud ruume või minimaalselt füüsiliselt eraldatud alasid: põhisegu ettevalmistamiseks, nukleiinhappe ekstraheerimiseks ja DNA matriitsi lisamiseks, amplifitseeritud toote amplifitseerimiseks ja käitlemiseks ning toote analüüsiks, nt geelelektroforeesiks.

Mõnes kohas on 4 eraldi ruumi omamine keeruline.Võimalik, kuid vähem soovitav variant on teha mastermixi ettevalmistamine isoleeritud alal, nt laminaarses voolukapis.Pesast PCR amplifikatsiooni korral tuleks mastermixi valmistamine teise ringi reaktsiooni jaoks ette valmistada mastermiksi valmistamise 'puhtal' alal, kuid primaarse PCR produktiga inokuleerimine tuleks teha amplifikatsiooniruumis ja võimalusel. selleks ettenähtud isolatsioonialal (nt laminaarvoolukapp).

Iga ruum/ala vajab eraldi komplekti selgelt märgistatud pipete, filtriotsikuid, katsutiriiulid, keeristeid, tsentrifuuge (vajaduse korral), pastakaid, üldisi laborireaktiive, laborikitleid ja kindakarpe, mis jäävad vastavatesse töökohtadesse.Määratud alade vahel liikudes tuleb käsi pesta ning kindaid ja laborikitleid vahetada.Reaktiive ja seadmeid ei tohi viia määrdunud alalt puhtasse kohta.Kui peaks juhtuma äärmuslik juhtum, kus reaktiivi või seadet tuleb tagurpidi liigutada, tuleb see esmalt puhastada 10% naatriumhüpokloritiga ja seejärel steriilse veega maha pühkida.

Märge

10% naatriumhüpokloriti lahust tuleb iga päev värskelt valmistada.Desinfitseerimiseks tuleb kinni pidada minimaalsest kokkupuuteajast 10 minutit.
Teise võimalusena võib kasutada müügilolevaid tooteid, mis on valideeritud DNA-d hävitavate pindade saasteainetena, kui kohalikud ohutussoovitused ei luba naatriumhüpokloriti kasutada või kui naatriumhüpoklorit ei sobi seadme metallosade puhastamiseks.

Ideaalis peaksid töötajad järgima ühesuunalist töövoo eetost ja mitte minema määrdunud aladelt (post-PCR) tagasi puhastele aladele (eel-PCR) samal päeval.Siiski võib ette tulla olukordi, mil see on vältimatu.Kui see juhtub, peavad töötajad hoolikalt pesema käed, vahetama kindaid, kasutama selleks ettenähtud laborikitlit ja mitte võtma kasutusele seadmeid, mida nad tahaksid uuesti ruumist välja viia, näiteks laboriraamatuid.Selliseid kontrollimeetmeid tuleks rõhutada töötajate molekulaarsete meetodite koolitusel.

Pärast kasutamist tuleb pingiruume puhastada 10% naatriumhüpokloritiga (millele järgneb steriilne vesi valgendi jääkide eemaldamiseks), 70% etanooliga või valideeritud kaubanduslikult saadava DNA-d hävitava saasteainega.Ideaalis tuleks paigaldada ultraviolett- (UV-) lambid, et võimaldada saaste eemaldamist kiiritamise teel.UV-lampide kasutamine peaks aga piirduma suletud tööaladega, nt turvakappidega, et piirata laboripersonali kokkupuudet UV-kiirgusega.Järgige tootja juhiseid UV-lambi hooldamise, ventilatsiooni ja puhastamise kohta, et tagada lampide töövõime.

Kui kasutate naatriumhüpokloriti asemel 70% etanooli, on puhastamise lõpuleviimiseks vaja kiiritada UV-valgusega.
Ärge puhastage keerist ja tsentrifuugige naatriumhüpokloritiga;selle asemel pühkige maha 70% etanooliga ja jätke UV-kiirguse kätte või kasutage kaubanduslikku DNA-d hävitavat saasteainet.Lekke korral pöörduge tootja poole, et saada täiendavaid puhastusnõuandeid.Kui tootja juhised seda lubavad, tuleb pipete regulaarselt autoklaavis steriliseerida.Kui pipette ei saa autoklaavida, peaks piisama nende puhastamisest 10% naatriumhüpokloritiga (millele järgneb põhjalik steriilse veega mahapühkimine) või kaubandusliku DNA-d hävitava saasteainega, millele järgneb UV-kiirgus.

Suure protsendisisaldusega naatriumhüpokloritiga puhastamine võib lõpuks kahjustada pipeti plastikut ja metalle, kui seda tehakse regulaarselt;kontrollige esmalt tootja soovitusi.Kõiki seadmeid tuleb regulaarselt kalibreerida vastavalt tootja soovitatud ajakavale.Määratud isik peaks vastutama kalibreerimisgraafiku järgimise, üksikasjalike logide pidamise ja hooldusmärgiste selgesti seadmetel kuvamise eest.

3. Kasutamis- ja puhastusnõuanded määratud molekulaarruumi jaoks

Eel-PCR: reaktiivi alikvootide jagamine / põhisegu ettevalmistamine: see peaks olema kõigist molekulaarsete katsete ettevalmistamiseks kasutatavatest ruumidest puhtaim ja ideaaljuhul peaks see olema UV-valgusega varustatud laminaarse voolu kapp.Proove, ekstraheeritud nukleiinhapet ja amplifitseeritud PCR-produkte ei tohi selles piirkonnas käsitseda.Amplifikatsioonireaktiive tuleks hoida sügavkülmikus (või külmikus, vastavalt tootja soovitustele) samas selleks ettenähtud kohas, ideaaljuhul laminaarvoolukapi või PCR-eelse ala kõrval.Kindaid tuleb vahetada iga kord, kui sisenete PCR-eelsesse piirkonda või laminaarvoolukappi.

PCR-eelset ala või laminaarvoolukappi tuleb enne ja pärast kasutamist puhastada järgmiselt: Pühkige kõik kapis olevad esemed, nt pipetid, otsikukarbid, vortex, tsentrifuug, katsutiriiulid, pliiatsid jne, 70% etanooli või kaubanduslikku DNA-d hävitavat saasteainet ja laske kuivada.Suletud tööpiirkonna, nt laminaarse voolukappi puhul jätke õhupuhasti 30 minutiks UV-valguse kätte.

Märge

Ärge jätke reaktiive UV-kiirguse kätte;liigutage need kappi alles siis, kui see on puhas.Kui teostate pöördtranskriptsiooni PCR-i, võib olla kasulik ka pindade ja seadmete pühkimine lahusega, mis kokkupuutel RNaasid lagundab.See võib aidata vältida RNA ensüümi lagunemise valenegatiivseid tulemusi.Pärast saastest puhastamist ja enne mastermixi valmistamist tuleb kindad veel kord vahetada ja seejärel on kapp kasutusvalmis.

Eel-PCR: nukleiinhappe ekstraheerimine/matriitsi lisamine:

Nukleiinhapet tuleb ekstraheerida ja käidelda teises määratud piirkonnas, kasutades eraldi pipettide, filtriotsikute, toruriiulite, värskete kindade, laborikittide ja muude seadmete komplekti. See ala on mõeldud ka malli, juhtnuppude ja trendijoonte lisamiseks mastermixi torud või plaadid.Analüüsitavate ekstraheeritud nukleiinhappeproovide saastumise vältimiseks on soovitatav enne positiivsete kontrollide või standardite käsitsemist kindaid vahetada ja kasutada eraldi pipettide komplekti.Sellesse piirkonda ei tohi pipeteerida PCR-reaktiive ja amplifitseeritud tooteid.Proove tuleb hoida selleks ettenähtud külmikutes või sügavkülmikutes samas piirkonnas.Näidistööpinda tuleks puhastada samamoodi nagu mastermixi ruumi.

Post-PCR: amplifitseeritud produkti amplifitseerimine ja käsitsemine

See määratud ruum on mõeldud amplifikatsioonijärgseteks protsessideks ja peaks olema PCR-eelsetest aladest füüsiliselt eraldi.Tavaliselt sisaldab see termotsükleid ja reaalajas platvorme ning ideaaljuhul peaks see sisaldama laminaarset voolukappi 1. ringi PCR produkti lisamiseks 2. ringi reaktsioonile, kui viiakse läbi pesastatud PCR.PCR-reagente ja ekstraheeritud nukleiinhapet ei tohi selles piirkonnas käsitseda, kuna saastumise oht on suur.Sellel alal peaks olema eraldi komplekt kindaid, laborikittleid, plaadi- ja toruriiulid, pipetid, filtriotsikud, prügikastid ja muud seadmed.Katseklaasid tuleb enne avamist tsentrifuugida.Näidistööpinda tuleks puhastada samamoodi nagu mastermixi ruumi.

Post-PCR: tooteanalüüs

See ruum on mõeldud toodete tuvastamise seadmete jaoks, nt geelelektroforeesipaagid, toiteplokid, UV-läbivalgustid ja geeli dokumentatsioonisüsteem.Sellel alal peaksid olema eraldi kindad, laborikitlid, plaadi- ja toruriiulid, pipetid, filtriotsikud, prügikastid ja muud seadmed.Sellesse piirkonda ei saa tuua muid reaktiive, välja arvatud laadimisvärv, molekulaarne marker ja agaroosgeel ning puhvri komponendid.Näidistööpinda tuleks puhastada samamoodi nagu mastermixi ruumi.

Oluline märkus

Ideaalis ei tohiks PCR-eelsetesse ruumidesse siseneda samal päeval, kui PCR-järgsetes ruumides on tööd juba tehtud.Kui see on täiesti vältimatu, peske esmalt hoolikalt käsi ja kandke ruumides spetsiaalseid laborikitleid.Laboriraamatuid ja pabereid ei tohi viia PCR-eelsesse ruumi, kui neid on kasutatud PCR-järgsetes ruumides;vajadusel võta protokollide/näidiste ID-de vms duplikaatprinte.

4. Üldised molekulaarbioloogia nõuanded

Katse inhibeerimise vältimiseks kasutage pulbrivaba kindaid.Õige pipeteerimistehnika on saastumise vähendamiseks ülimalt oluline.Vale pipeteerimine võib põhjustada vedelike väljastamisel pritsimist ja aerosoolide teket.Õige pipeteerimise hea tava leiate järgmistelt linkidelt: Gilsoni pipeteerimise juhend, Anachemi pipeteerimistehnika videod, Tsentrifuugituubid enne avamist ja pritsimise vältimiseks avage need ettevaatlikult.Sulgege torud kohe pärast kasutamist, et vältida saasteainete sattumist.

Mitme reaktsiooni läbiviimisel valmistage üks põhisegu, mis sisaldab tavalisi reagente (nt vett, dNTP-sid, puhvrit, praimereid ja ensüümi), et minimeerida reaktiivi ülekannete arvu ja vähendada saastumise ohtu.Mastermix on soovitatav püstitada jääle või külmaplokile.Hot Start ensüümi kasutamine võib aidata vähendada mittespetsiifiliste toodete tootmist.Kaitske fluorestseeruvaid sonde sisaldavaid reaktiive valguse eest, et vältida lagunemist.

5. Sisekontroll

Kaasake hästi iseloomustatud, kinnitatud positiivsed ja negatiivsed kontrollid, mallideta kontroll kõikides reaktsioonides ja mitmepunktiline tiitritud trendijoon kvantitatiivsete reaktsioonide jaoks.Positiivne kontroll ei tohiks olla nii tugev, et see kujutaks endast saastumise ohtu.Kaasake nukleiinhappe ekstraheerimisel positiivsed ja negatiivsed ekstraheerimise kontrollid.

Soovitatav on panna igasse piirkonda selged juhised, et kasutajad oleksid käitumisreeglitest teadlikud.Diagnostikalaborid, mis tuvastavad kliinilistes proovides DNA või RNA väga madala taseme, võivad soovida kasutusele võtta täiendava turvameetme, milleks on eraldi õhukäitlussüsteemid, mille õhurõhk on PCR-eelsetes ruumides ja kergelt negatiivne õhurõhk PCR-i järgsetes ruumides.

Lõpuks on abi kvaliteedi tagamise (QA) plaani väljatöötamisest.Selline plaan peaks sisaldama reaktiivide põhivarude ja töövarude loendeid, komplektide ja reaktiivide säilitamise eeskirju, kontrollitulemuste aruandlust, töötajate koolitusprogramme, tõrkeotsingu algoritme ja vajadusel parandusmeetmeid.

6. Bibliograafia

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. 3. peatükk: qPCR labori seadistamine.Juhenddokument harrastusvete testimiseks USEPA qPCR meetodil 1611. Lansing-Michigani osariigi ülikool.

Inglismaa rahvatervis, NHS.Ühendkuningriigi standardid mikrobioloogiliste uuringute jaoks: hea laboritava molekulaarse amplifikatsiooni analüüside läbiviimisel).Kvaliteedijuhised.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. PCR labori sisseseadmine.Cold Spring Harbi protokoll.2007;7.

Schroeder S 2013. Tsentrifuugide tavahooldus: tsentrifuugide, rootorite ja adapterite puhastamine, hooldus ja desinfitseerimine (Valge paber nr 14).Hamburg: Eppendorf;2013. aasta.

Viana RV, Wallis CL.Hea kliinilise labori tava (GCLP) diagnostikalaborites kasutatavate molekulaarsete testide jaoks, In: Akyar I, toimetaja.Lai kvaliteedikontrolli spekter.Rijeka, Horvaatia: Intech;2011: 29–52.