Los métodos de detección molecular tienen la capacidad de producir un gran volumen de ácido nucleico mediante la amplificación de cantidades traza que se encuentran en las muestras.Si bien esto es beneficioso para permitir una detección sensible, también introduce la posibilidad de contaminación a través de la propagación de aerosoles de amplificación en el entorno del laboratorio.Al realizar experimentos, se pueden tomar medidas para evitar la contaminación de los reactivos, el equipo de laboratorio y el espacio del banco, ya que dicha contaminación puede generar resultados falsos positivos (o falsos negativos).

Para ayudar a reducir la probabilidad de contaminación, se deben aplicar las Buenas Prácticas de Laboratorio en todo momento.En concreto, se deben tomar precauciones en los siguientes puntos:

1. Manipulación de reactivos
2. Organización del espacio de trabajo y equipamiento
3. Consejos de uso y limpieza para el espacio molecular designado
4. Consejos generales de biología molecular
5. Controles internos
6. Bibliografía

1. Manipulación de reactivos

Centrifugar brevemente los tubos de reactivos antes de abrirlos para evitar la generación de aerosoles.Reactivos en alícuotas para evitar congelaciones y descongelaciones múltiples y la contaminación de las reservas maestras.Etiquete y feche claramente todos los reactivos y tubos de reacción y mantenga registros de los números de lotes y lotes de reactivos utilizados en todos los experimentos.Pipetee todos los reactivos y muestras utilizando puntas con filtro.Previo a la compra, es recomendable confirmar con el fabricante que las puntas con filtro se ajustan a la marca de pipeta a utilizar.

2. Organización del espacio de trabajo y equipamiento

El espacio de trabajo debe organizarse para garantizar que el flujo de trabajo se produzca en una dirección, desde áreas limpias (pre-PCR) hasta áreas sucias (post-PCR).Las siguientes precauciones generales ayudarán a reducir la posibilidad de contaminación.Disponga de salas designadas separadas o, como mínimo, áreas separadas físicamente, para: preparación de la mezcla maestra, extracción de ácidos nucleicos y adición de moldes de ADN, amplificación y manipulación del producto amplificado y análisis del producto, por ejemplo, electroforesis en gel.

En algunos entornos, es difícil tener 4 habitaciones separadas.Una opción posible pero menos deseable es realizar la preparación de la mezcla maestra en un área de contención, por ejemplo, una cabina de flujo laminar.En el caso de la amplificación por PCR anidada, la preparación de la mezcla maestra para la segunda ronda de reacción debe realizarse en el área 'limpia' para la preparación de la mezcla maestra, pero la inoculación con el producto de la PCR primaria debe realizarse en la sala de amplificación y, si es posible, en un área de contención dedicada (por ejemplo, una cabina de flujo laminar).

Cada habitación/área necesita un juego separado de pipetas, puntas de filtro, gradillas para tubos, vórtices, centrífugas (si corresponde), bolígrafos, reactivos de laboratorio genéricos, batas de laboratorio y cajas de guantes claramente etiquetados que permanecerán en sus respectivas estaciones de trabajo.Se deben lavar las manos y cambiarse los guantes y batas de laboratorio al moverse entre las áreas designadas.Los reactivos y el equipo no deben trasladarse de un área sucia a un área limpia.Si surgiera un caso extremo en el que un reactivo o pieza de equipo deba moverse hacia atrás, primero debe descontaminarse con hipoclorito de sodio al 10%, seguido de una limpieza con agua esterilizada.

Nota

La solución de hipoclorito de sodio al 10 % debe renovarse diariamente.Cuando se utiliza para la descontaminación, debe respetarse un tiempo mínimo de contacto de 10 minutos.
Alternativamente, los productos disponibles en el mercado que están validados como descontaminantes de superficies que destruyen el ADN pueden usarse si las recomendaciones de seguridad locales no permiten el uso de hipoclorito de sodio o si el hipoclorito de sodio no es adecuado para descontaminar las partes metálicas del equipo.

Idealmente, el personal debe cumplir con el espíritu de flujo de trabajo unidireccional y no pasar de áreas sucias (post-PCR) a áreas limpias (pre-PCR) el mismo día.Sin embargo, puede haber ocasiones en que esto sea inevitable.Cuando se presente tal ocasión, el personal debe tener cuidado de lavarse bien las manos, cambiarse los guantes, usar la bata de laboratorio designada y no volver a introducir ningún equipo que quiera sacar de la sala, como libros de laboratorio.Estas medidas de control deben enfatizarse en la capacitación del personal sobre métodos moleculares.

Después de su uso, los espacios del banco deben limpiarse con hipoclorito de sodio al 10 % (seguido de agua esterilizada para eliminar los residuos de lejía), etanol al 70 % o un descontaminante que destruya el ADN disponible en el mercado y validado.Idealmente, deberían instalarse lámparas ultravioleta (UV) para permitir la descontaminación por irradiación.Sin embargo, el uso de lámparas UV debe restringirse a áreas de trabajo cerradas, por ejemplo, gabinetes de seguridad, para limitar la exposición UV del personal del laboratorio.Siga las instrucciones del fabricante para el cuidado, la ventilación y la limpieza de las lámparas UV para garantizar que las lámparas sigan siendo eficaces.

Si usa etanol al 70 % en lugar de hipoclorito de sodio, será necesaria la irradiación con luz ultravioleta para completar la descontaminación.
No limpie el vortex y la centrífuga con hipoclorito de sodio;en su lugar, limpie con etanol al 70 % y exponga a la luz ultravioleta, o use un descontaminante comercial que destruya el ADN.Para derrames, consulte con el fabricante para obtener más consejos de limpieza.Si las instrucciones del fabricante lo permiten, las pipetas deben esterilizarse rutinariamente en autoclave.Si las pipetas no se pueden esterilizar en autoclave, debería ser suficiente limpiarlas con hipoclorito de sodio al 10 % (seguido de una limpieza profunda con agua esterilizada) o con un descontaminante comercial que destruya el ADN seguido de exposición a los rayos UV.

La limpieza con hipoclorito de sodio de alto porcentaje puede eventualmente dañar los plásticos y metales de las pipetas si se realiza con regularidad;verifique primero las recomendaciones del fabricante.Todo el equipo debe calibrarse regularmente de acuerdo con el programa recomendado por el fabricante.Una persona designada debe estar a cargo de garantizar que se cumpla el programa de calibración, que se mantengan registros detallados y que las etiquetas de servicio se muestren claramente en el equipo.

3. Consejos de uso y limpieza para el espacio molecular designado

Pre-PCR: alícuotas de reactivos/preparación de la mezcla maestra: este debe ser el más limpio de todos los espacios utilizados para la preparación de experimentos moleculares e idealmente debe ser un gabinete de flujo laminar equipado con una luz ultravioleta.Las muestras, el ácido nucleico extraído y los productos de PCR amplificados no deben manipularse en esta área.Los reactivos de amplificación deben conservarse en un congelador (o refrigerador, según las recomendaciones del fabricante) en el mismo espacio designado, idealmente junto a la cabina de flujo laminar o el área de pre-PCR.Los guantes deben cambiarse cada vez que ingrese al área de pre-PCR o al gabinete de flujo laminar.

El área previa a la PCR o la cabina de flujo laminar deben limpiarse antes y después de su uso de la siguiente manera: Limpie todos los elementos de la cabina, por ejemplo, pipetas, cajas de puntas, vórtex, centrífuga, gradillas para tubos, bolígrafos, etc. con etanol al 70 % o un descontaminante comercial que destruye el ADN y déjelo secar.En el caso de un área de trabajo cerrada, por ejemplo, una cabina de flujo laminar, exponga la campana a la luz ultravioleta durante 30 minutos.

Nota

No exponga los reactivos a la luz ultravioleta;solo muévalos al gabinete una vez que esté limpio.Si realiza una PCR de transcripción inversa, también puede ser útil limpiar las superficies y el equipo con una solución que descomponga las ARNasas al contacto.Esto puede ayudar a evitar resultados falsos negativos de la degradación enzimática del ARN.Después de la descontaminación y antes de preparar la mezcla maestra, se deben cambiar los guantes una vez más y luego el gabinete está listo para usar.

Pre-PCR: extracción de ácido nucleico/adición de plantilla:

El ácido nucleico debe extraerse y manipularse en una segunda área designada, utilizando un juego separado de pipetas, puntas con filtro, gradillas para tubos, guantes limpios, batas de laboratorio y otros equipos. Esta área también es para agregar plantillas, controles y líneas de tendencia al tubos o placas mastermix.Para evitar la contaminación de las muestras de ácido nucleico extraídas que se están analizando, se recomienda cambiarse los guantes antes de manipular controles positivos o estándares y usar un juego de pipetas por separado.Los reactivos de PCR y los productos amplificados no deben pipetearse en esta área.Las muestras deben almacenarse en refrigeradores o congeladores designados en la misma área.El espacio de trabajo de muestra debe limpiarse de la misma manera que el espacio de mezcla maestra.

Post-PCR: Amplificación y manejo del producto amplificado

Este espacio designado es para procesos posteriores a la amplificación y debe estar físicamente separado de las áreas previas a la PCR.Por lo general, contiene termocicladores y plataformas en tiempo real, e idealmente debería tener un gabinete de flujo laminar para agregar el producto de PCR de la ronda 1 a la reacción de la ronda 2, si se está realizando una PCR anidada.Los reactivos de PCR y el ácido nucleico extraído no deben manipularse en esta área ya que el riesgo de contaminación es alto.Esta área debe tener un juego separado de guantes, batas de laboratorio, gradillas para placas y tubos, pipetas, puntas con filtro, recipientes y otros equipos.Los tubos deben centrifugarse antes de abrirlos.El espacio de trabajo de muestra debe limpiarse de la misma manera que el espacio de mezcla maestra.

Post-PCR: análisis del producto

Esta sala es para equipos de detección de productos, por ejemplo, tanques de electroforesis en gel, fuentes de alimentación, transiluminador UV y el sistema de documentación de gel.Esta área debe tener juegos separados de guantes, batas de laboratorio, gradillas para placas y tubos, pipetas, puntas con filtro, recipientes y otros equipos.No se pueden llevar otros reactivos a esta área, excepto el colorante de carga, el marcador molecular, el gel de agarosa y los componentes del tampón.El espacio de trabajo de muestra debe limpiarse de la misma manera que el espacio de mezcla maestra.

Nota IMPORTANTE

Idealmente, no se debe ingresar a las salas previas a la PCR el mismo día si ya se ha trabajado en las salas posteriores a la PCR.Si esto es completamente inevitable, asegúrese de lavarse bien las manos primero y usar batas de laboratorio específicas en las habitaciones.Los libros de laboratorio y el papeleo no deben llevarse a las salas previas a la PCR si se han utilizado en las salas posteriores a la PCR;si es necesario, tome impresiones duplicadas de protocolos/ID de muestra, etc.

4. Consejos generales de biología molecular

Utilice guantes sin talco para evitar la inhibición del ensayo.La técnica de pipeteo correcta es fundamental para reducir la contaminación.El pipeteo incorrecto puede provocar salpicaduras al dispensar líquidos y la creación de aerosoles.Se pueden encontrar buenas prácticas para el pipeteo correcto en los siguientes enlaces: Guía de Gilson para el pipeteo, Vídeos de la técnica de pipeteo de Anachem, Centrifugue los tubos antes de abrirlos y ábralos con cuidado para evitar salpicaduras.Cierre los tubos inmediatamente después de su uso para evitar la introducción de contaminantes.

Cuando realice varias reacciones, prepare una mezcla maestra que contenga reactivos comunes (p. ej., agua, dNTP, tampón, cebadores y enzimas) para minimizar el número de transferencias de reactivos y reducir el riesgo de contaminación.Se recomienda configurar la mezcla maestra en hielo o en un bloque frío.El uso de una enzima Hot Start puede ayudar a reducir la producción de productos no específicos.Proteja los reactivos que contienen sondas fluorescentes de la luz para evitar la degradación.

5. Controles internos

Incluya controles positivos y negativos bien caracterizados y confirmados, junto con un control sin plantilla en todas las reacciones, y una línea de tendencia titulada multipunto para las reacciones cuantitativas.El control positivo no debe ser tan fuerte que suponga un riesgo de contaminación.Incluya controles de extracción positivos y negativos al realizar la extracción de ácidos nucleicos.

Se recomienda colocar instrucciones claras en cada una de las áreas para que los usuarios conozcan las normas de conducta.Los laboratorios de diagnóstico que detectan niveles muy bajos de ADN o ARN en muestras clínicas pueden querer adoptar la medida de seguridad adicional de tener sistemas de manejo de aire separados con presión de aire ligeramente positiva en las salas previas a la PCR y presión de aire ligeramente negativa en las salas posteriores a la PCR.

Por último, es útil desarrollar un plan de control de calidad (QA).Dicho plan debe incluir listas de existencias maestras de reactivos y existencias de trabajo, reglas para almacenar kits y reactivos, informes de resultados de control, programas de capacitación del personal, algoritmos de resolución de problemas y acciones correctivas cuando sea necesario.

6. Bibliografía

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