Molekulaj detektmetodoj havas la kapablon produkti grandan volumenon de nuklea acido tra la plifortigo de spurkvantoj trovitaj en provaĵoj.Dum tio estas utila por ebligi senteman detekton, ĝi ankaŭ enkondukas la eblecon de poluado per la disvastigo de plifortigaj aerosoloj en la laboratoriomedio.Dum farado de eksperimentoj, mezuroj povas esti entreprenitaj por eviti la poluadon de reakciiloj, laboratoriekipaĵo kaj benkospaco, ĉar tia poluado povas generi malverajn pozitivajn (aŭ malverenegativajn) rezultojn.

Por helpi redukti la probablon de poluado, Bona Labora Praktiko devas esti ekzercita ĉiam.Specife, oni devas preni singardecojn pri la sekvaj punktoj:

1. Manipulado de reakciiloj
2. Organizo de laborspaco kaj ekipaĵo
3. Konsiloj pri uzo kaj purigado por la elektita molekula spaco
4. Ĝenerala molekula biologia konsilo
5. Internaj kontroloj
6. Bibliografio

1. Manipulado de reakciiloj

Mallonge centrifugu reakcigajn tubojn antaŭ malfermiĝi por eviti la generadon de aerosoloj.Alikvotaj reakciiloj por eviti multoblajn frostig-degelojn kaj la poluadon de majstraj akcioj.Klare etikedu kaj datigu ĉiujn reakcigajn kaj reakcitubojn kaj konservu protokolojn de reakciaĵlotaj kaj aroj uzataj en ĉiuj eksperimentoj.Pipetu ĉiujn reakcilojn kaj specimenojn per filtrilaj pintoj.Antaŭ aĉeto, estas konsilinde konfirmi kun la fabrikanto, ke la filtrilaj pintoj taŭgas por la marko de pipeta uzota.

2. Organizo de laborspaco kaj ekipaĵo

Laborspaco devus esti organizita por certigi, ke la fluo de laboro okazas en unu direkto, de puraj areoj (antaŭ-PCR) ĝis malpuraj areoj (post-PCR).La sekvaj ĝeneralaj antaŭzorgoj helpos redukti la eblecon de poluado.Havu apartajn destinitajn ĉambrojn, aŭ minimume fizike apartajn areojn, por: preparado de majstra miksaĵo, eltiro de nukleaj acidoj kaj aldono de DNA-ŝablono, plifortigo kaj manipulado de plifortigita produkto, kaj analizo de produkto, ekz. ĝelelektroforezo.

En iuj agordoj, havi 4 apartajn ĉambrojn estas malfacila.Ebla sed malpli dezirinda elekto estas fari la majstran miksaĵpreparon en retena areo, ekz. kabineto de lamena fluo.En la kazo de nestita PCR-plifortigo, la preparado de la majstra miksaĵo por la duaraŭnda reago devus esti preta en la "pura" areo por mastermiksaĵo, sed la inokulado kun la primara PCR-produkto devas esti farita en la plifortiga ĉambro, kaj se eble. en dediĉita retenejo (ekz. kabineto de lamina fluo).

Ĉiu ĉambro/areo bezonas apartan aron de klare etikeditaj pipetoj, filtrilaj pintoj, tubrakoj, vorticos, centrifugiloj (se signifa), plumoj, senmarkaj laboratorioreakciiloj, laboratoriomanteloj kaj skatoloj da gantoj kiuj restos ĉe siaj respektivaj laborstacioj.Manoj devas esti lavitaj kaj gantoj kaj laboratoriomanteloj ŝanĝitaj kiam moviĝas inter la difinitaj areoj.Reakciiloj kaj ekipaĵo ne devas esti movitaj de malpura areo al pura areo.Se okazus ekstrema kazo kie reakciilo aŭ peco de ekipaĵo devas esti movita malantaŭen, ĝi unue devas esti senpoluigita kun 10% natria hipoklorito, sekvita per viŝo malsupren kun sterila akvo.

Notu

La 10% natria hipoklorita solvo devas esti farita freŝa ĉiutage.Se uzite por senpoluado, minimuma kontakta tempo de 10 minutoj devas esti observita.
Alternative, komerce haveblaj produktoj kiuj estas konfirmitaj kiel DNA-detruantaj surfacmalpurigaĵoj povas esti uzitaj se lokaj sekurecrekomendoj ne permesas la uzon de natria hipoklorito aŭ se natria hipoklorito ne estas taŭga por senpoluigado de la metalaj partoj de ekipaĵo.

Ideale, dungitaro devas observi la unudirektan laborfluan etoso kaj ne iri de malpuraj areoj (post-PCR) reen al puraj areoj (antaŭ-PCR) en la sama tago.Tamen, povas esti okazoj kiam ĉi tio estas neevitebla.Kiam tia okazo aperas, dungitaro devas zorgi ĝisfunde lavi manojn, ŝanĝi gantojn, uzi la elektitan laboratoriomantelon kaj ne enkonduki ajnan ekipaĵon, kiun ili volas denove elpreni el la ĉambro, kiel laboratoriolibroj.Tiaj kontroliniciatoj devus esti emfazitaj en dungitaro-trejnado pri molekulaj metodoj.

Post uzo, benkospacoj devas esti purigitaj kun 10% natria hipoklorito (sekvita de sterila akvo por forigi restan blankigilon), 70% etanolo, aŭ validigita komerce havebla DNA-detruanta malpurigaĵo.Ideale, ultraviolaj (UV) lampoj devus esti konvenitaj por ebligi senpoluadon per surradiado.Tamen, la uzo de UV-lampoj devus esti limigita al fermitaj laborareoj, ekz. sekurecaj kabinetoj, por limigi la UV-ekspozicion de la laboratoriopersonaro.Bonvolu observi la instrukciojn de la fabrikanto pri prizorgado, ventolado kaj purigado de UV-lampo por certigi, ke lampoj restu efikaj.

Se uzado de 70% etanolo anstataŭ natria hipoklorito, surradiado kun UV-lumo estos necesa por kompletigi la senpoluadon.
Ne purigu la vorticon kaj centrifugu per natria hipoklorito;anstataŭe, viŝu malsupren per 70% etanolo kaj elmontru al UV-lumo, aŭ uzu komercan DNA-detruantan malpurigaĵon.Por verŝoj, kontrolu kun la fabrikanto por pliaj konsiloj pri purigado.Se la instrukcioj de la fabrikanto permesas ĝin, pipetoj devas esti rutine steriligitaj per aŭtoklavo.Se pipetoj ne povas esti aŭtoklavigitaj, devus sufiĉi purigi ilin per 10% natria hipoklorito (sekvita de ĝisfunda viŝado kun sterila akvo) aŭ kun komerca DNA-detruanta malpurigilo sekvita de UV-eksponiĝo.

Purigado kun alt-procenta natria hipoklorito povas eventuale damaĝi pipetajn plastojn kaj metalojn se farite regule;kontrolu unue rekomendojn de la fabrikanto.Ĉiuj ekipaĵoj devas esti kalibritaj regule laŭ la fabrikisto rekomendita horaro.Destinita persono devas zorgi pri tio, ke la kalibra horaro estas observata, ke detalaj protokoloj estas konservitaj, kaj ke servo-etikedoj estas klare montrataj sur ekipaĵo.

3. Konsiloj pri uzo kaj purigado por la elektita molekula spaco

Antaŭ-PCR: Reakciaĵo alikvotado/mastra miksaĵo: Ĉi tio devus esti la plej pura el ĉiuj spacoj uzataj por la preparado de molekulaj eksperimentoj kaj devus ideale esti elektita laminarflua kabineto ekipita per UV-lumo.Provaĵoj, ĉerpita nuklea acido kaj plifortigitaj PCR-produktoj ne devas esti pritraktitaj en ĉi tiu areo.Plifortigaj reakciiloj devas esti konservitaj en frostujo (aŭ fridujo, laŭ fabrikisto-rekomendoj) en la sama difinita spaco, ideale apud la laminara fluo-kabineto aŭ antaŭ-PCR-areo.Gantoj devas esti ŝanĝitaj ĉiufoje enirante la antaŭ-PCR-areon aŭ lamenfluan kabineton.

La antaŭ-PCR-areo aŭ lamenflua kabineto devas esti purigitaj antaŭ kaj post uzo jene: Forviŝu ĉiujn erojn en la kabineto, ekz. pipetoj, pintskatoloj, vortico, centrifugilo, tubrakoj, plumoj, ktp. kun 70% etanolo aŭ komerca DNA-detruanta malpurigaĵo, kaj lasu sekiĝi.En la kazo de fermita laborareo, ekz. kabineto de lamina fluo, elmetas la kapuĉon al UV-lumo dum 30 minutoj.

Notu

Ne elmontru reactivojn al UV-lumo;movu ilin en la kabineton nur post kiam ĝi estas pura.Se plenumante inversan transskriban PCR, ĝi ankaŭ povas esti helpema forviŝi surfacojn kaj ekipaĵon per solvo, kiu malkonstruas RNazojn ĉe kontakto.Tio povas helpi eviti fals-negativajn rezultojn de enzimdegenero de RNA.Post senpoluigo kaj antaŭ prepari la majstran miksaĵon, gantoj devas esti ŝanĝitaj denove, kaj tiam la kabineto estas preta por uzi.

Antaŭ-PCR: Nukleacida eltiro/ŝablono-aldono:

Nukleika acido devas esti ĉerpita kaj manipulita en dua destinita areo, uzante apartan aron da pipetoj, filtrilaj pintoj, tuboj, freŝaj gantoj, laboratoriaj vestoj kaj aliaj ekipaĵoj. Ĉi tiu areo estas ankaŭ por aldono de ŝablonoj, kontroloj kaj tendenclinioj al la mastermix tuboj aŭ teleroj.Por eviti poluadon de la analizitaj specimenoj ĉerpitaj de nuklea acido, oni rekomendas ŝanĝi gantojn antaŭ manipuli pozitivajn kontrolojn aŭ normojn kaj uzi apartan aron da pipetoj.PCR-reakciiloj kaj plifortigitaj produktoj ne devas esti pipetitaj en ĉi tiu areo.Specimenoj devas esti stokitaj en elektitaj fridujoj aŭ frostujoj en la sama areo.La ekzempla laborspaco devas esti purigita en la sama maniero kiel la mastermix-spaco.

Post-PCR: Plifortigo kaj manipulado de la plifortigita produkto

Ĉi tiu elektita spaco estas por post-plifortigaj procezoj kaj devus esti fizike aparta de la antaŭ-PCR-areoj.Ĝi kutime enhavas termociklantojn kaj realtempajn platformojn, kaj ideale devus havi lamenfluan kabineton por aldoni la rondan 1 PCR-produkton al la ronda 2-reago, se nestita PCR estas farita.PCR-reakciiloj kaj ĉerpita nuklea acido ne devas esti pritraktitaj en tiu areo ĉar la risko de poluado estas alta.Ĉi tiu areo devus havi apartan aron de gantoj, laboratorio-manteloj, teleraj kaj tuboj, pipetoj, filtrilaj pintoj, rubujoj kaj aliaj ekipaĵoj.Tuboj devas esti centrifugitaj antaŭ malfermiĝi.La ekzempla laborspaco devas esti purigita en la sama maniero kiel la mastermix-spaco.

Post-PCR: Produkta analizo

Ĉi tiu ĉambro estas por produkta detekta ekipaĵo, ekz. ĝelaj elektroforezaj tankoj, elektraj pakoj, UV-translumilo kaj la ĝela dokumenta sistemo.Ĉi tiu areo devus havi apartajn arojn de gantoj, laboratorio-manteloj, teleraj kaj tuboj, pipetoj, filtrilaj pintoj, rubujoj kaj aliaj ekipaĵoj.Neniuj aliaj reakciiloj povas esti alportitaj en ĉi tiun areon, ekskludante ŝarĝan tinkturfarbon, molekulan signon kaj agarozĝelon, kaj bufrokomponentojn.La ekzempla laborspaco devas esti purigita en la sama maniero kiel la mastermix-spaco.

Grava noto

Ideale, la antaŭ-PCR-ĉambroj ne devus esti eniritaj en la sama tago se laboro jam estis farita en la post-PCR-ĉambroj.Se ĉi tio estas tute neevitebla, certigu, ke la manoj estas unue plene lavitaj kaj ke specifaj laboratoriovestoj estas portitaj en la ĉambroj.Laboratoriaj libroj kaj paperaĵoj ne devas esti prenitaj en la antaŭ-PCR-ĉambrojn se ili estis uzitaj en la post-PCR-ĉambroj;se necese, prenu duplikatajn presaĵojn de protokoloj/ekzemplaj identigiloj ktp.

4. Ĝenerala molekula biologia konsilo

Uzu senpulvorajn gantojn por eviti provon-inhibicion.Ĝusta pipeta tekniko estas plej grava por redukti poluadon.Malĝusta pipetado povas rezultigi ŝprucigadon dum likvaĵoj kaj kreado de aerosoloj.Bonan praktikon por ĝusta pipetado troveblas ĉe la sekvaj ligiloj: Gilson-gvidilo pri pipetado, Anachem-pipettekniko-filmetoj, Centrifugaj tuboj antaŭ malfermiĝi, kaj malfermu ilin zorge por eviti plaŭdon.Fermu tubojn tuj post uzo por eviti enkondukon de poluaĵoj.

Kiam vi faras multoblajn reagojn, preparu unu majstran miksaĵon enhavantan komunajn reakcilojn (ekz. akvon, dNTP-ojn, bufron, enkondukojn kaj enzimon) por minimumigi la nombron da reakciiloj kaj redukti la minacon de poluado.Oni rekomendas starigi la majstran miksaĵon sur glacio aŭ malvarma bloko.Uzo de Hot Start-enzimo povas helpi redukti la produktadon de nespecifaj produktoj.Protektu reakcilojn enhavantajn fluoreskajn sondilojn de lumo por eviti degradadon.

5. Internaj kontroloj

Inkluzivi bone karakterizitajn, konfirmitajn pozitivajn kaj negativajn kontrolojn, kune kun senŝablona kontrolo en ĉiuj reagoj, kaj plurpunktan titolitan tendencon por kvantaj reagoj.La pozitiva kontrolo ne devus esti tiel forta, ke ĝi prezentas riskon de poluado.Inkluzivi pozitivajn kaj negativajn eltirajn kontrolojn dum elfarado de nukleaacida eltiro.

Oni rekomendas, ke klaraj instrukcioj estu afiŝitaj en ĉiu el la areoj por ke uzantoj konsciu pri reguloj de konduto.Diagnozaj laboratorioj detektantaj tre malaltajn nivelojn de DNA aŭ RNA en klinikaj provaĵoj eble volas adopti la kroman sekureciniciaton havi apartajn aertraktadsistemojn kun iomete pozitiva aerpremo en la antaŭ-PCR-ĉambroj kaj iomete negativa aerpremo en la post-PCR-ĉambroj.

Finfine, evoluigi kvalitan certigon (QA) plano estas helpema.Tia plano devus inkluzivi listojn de reakciantaj majstraj akcioj kaj laborakcioj, reguloj por stokado de ilaroj kaj reakciiloj, raportado de kontrolrezultoj, kunlaborantaro-trejnadprogramoj, problemojn-algoritmoj, kaj kuracaj agoj kiam bezonite.

6. Bibliografio

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Ĉapitro 3: Establigo de qPCR-laboratorio.Gviddokumento por testado de distraj akvoj uzante USEPA qPCR-metodon 1611. Lansing- Michigan State University.

Publika Sano Anglio, NHS.UK-normoj por mikrobiologiaj esploroj: Bona Laboratory Practice dum elfarado de molekulaj plifortigaj analizoj).Kvalita Gvido.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Starigante PCR-laboratorion.Malvarma Printempo Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Rutina prizorgado de centrifugiloj: purigado, prizorgado kaj desinfektado de centrifugiloj, rotoroj kaj adaptiloj (Blanka libro n-ro 14).Hamburgo: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) por molekulaj testoj uzataj en diagnozaj laboratorioj, En: Akyar I, redaktisto.Larĝaj spektroj de kvalito-kontrolo.Rijeka, Kroatio: Intech;2011: 29–52.