Οι μέθοδοι μοριακής ανίχνευσης έχουν την ικανότητα να παράγουν μεγάλο όγκο νουκλεϊκού οξέος μέσω της ενίσχυσης ιχνών ποσοτήτων που βρίσκονται στα δείγματα.Αν και αυτό είναι ευεργετικό για την ευαισθησία της ανίχνευσης, εισάγει επίσης την πιθανότητα μόλυνσης μέσω της εξάπλωσης αερολυμάτων ενίσχυσης στο εργαστηριακό περιβάλλον.Κατά τη διεξαγωγή πειραμάτων, μπορούν να ληφθούν μέτρα για την αποφυγή της μόλυνσης των αντιδραστηρίων, του εργαστηριακού εξοπλισμού και του χώρου του πάγκου, καθώς μια τέτοια μόλυνση μπορεί να προκαλέσει ψευδώς θετικά (ή ψευδώς αρνητικά) αποτελέσματα.

Για να μειωθεί η πιθανότητα μόλυνσης, θα πρέπει να εφαρμόζεται ανά πάσα στιγμή η Ορθή Εργαστηριακή Πρακτική.Συγκεκριμένα, θα πρέπει να λαμβάνονται προφυλάξεις σχετικά με τα ακόλουθα σημεία:

1. Χειρισμός αντιδραστηρίων
2. Οργάνωση χώρου εργασίας και εξοπλισμού
3. Συμβουλές χρήσης και καθαρισμού για τον καθορισμένο μοριακό χώρο
4. Γενικές συμβουλές μοριακής βιολογίας
5. Εσωτερικοί έλεγχοι
6. Βιβλιογραφία

1. Χειρισμός αντιδραστηρίων

Φυγοκεντρήστε σύντομα τους σωλήνες αντιδραστηρίου πριν ανοίξετε για να αποφύγετε τη δημιουργία αερολυμάτων.Υποπολλαπλάσια αντιδραστήρια για την αποφυγή πολλαπλών παγώσεων-απόψυξης και μόλυνσης των βασικών αποθεμάτων.Σημειώστε με σαφήνεια και ημερομηνία όλα τα αντιδραστήρια και τους σωλήνες αντίδρασης και διατηρήστε αρχεία καταγραφής των αριθμών παρτίδας και παρτίδων αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται σε όλα τα πειράματα.Μεταφέρετε με σιφώνιο όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα χρησιμοποιώντας ρύγχη φίλτρου.Πριν από την αγορά, συνιστάται να επιβεβαιώσετε με τον κατασκευαστή ότι τα άκρα του φίλτρου ταιριάζουν στη μάρκα της πιπέτας που θα χρησιμοποιηθεί.

2. Οργάνωση χώρου εργασίας και εξοπλισμού

Ο χώρος εργασίας θα πρέπει να είναι οργανωμένος ώστε να διασφαλίζεται ότι η ροή της εργασίας γίνεται προς μία κατεύθυνση, από καθαρούς χώρους (προ-PCR) έως βρώμικους χώρους (μετά-PCR).Οι ακόλουθες γενικές προφυλάξεις θα βοηθήσουν στη μείωση της πιθανότητας μόλυνσης.Έχετε ξεχωριστούς καθορισμένους χώρους, ή τουλάχιστον φυσικά ξεχωριστούς χώρους, για: προετοιμασία mastermix, εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος και προσθήκη προτύπου DNA, ενίσχυση και χειρισμό ενισχυμένου προϊόντος και ανάλυση προϊόντος, π.χ. ηλεκτροφόρηση γέλης.

Σε ορισμένες ρυθμίσεις, το να έχεις 4 ξεχωριστά δωμάτια είναι δύσκολο.Μια πιθανή αλλά λιγότερο επιθυμητή επιλογή είναι να κάνετε την προετοιμασία του mastermix σε μια περιοχή περιορισμού, π.χ. σε ένα θάλαμο στρωτής ροής.Στην περίπτωση της ένθετης ενίσχυσης PCR, η προετοιμασία του mastermix για τον δεύτερο γύρο αντίδραση θα πρέπει να προετοιμαστεί στην «καθαρή» περιοχή για την προετοιμασία του mastermix, αλλά ο εμβολιασμός με το πρωτεύον προϊόν PCR θα πρέπει να γίνει στο δωμάτιο ενίσχυσης και, εάν είναι δυνατόν σε ειδικό χώρο περιορισμού (π.χ. θάλαμος στρωτής ροής).

Κάθε δωμάτιο/περιοχή χρειάζεται ένα ξεχωριστό σετ από σαφείς πιπέτες, άκρες φίλτρων, σχάρες σωλήνων, στροβιλισμούς, φυγόκεντρους (αν υπάρχουν), στυλό, αντιδραστήρια εργαστηρίου γενικής χρήσης, εργαστηριακά παλτά και κουτιά με γάντια που θα παραμείνουν στους αντίστοιχους σταθμούς εργασίας τους.Τα χέρια πρέπει να πλένονται και να αλλάζονται γάντια και παλτό εργαστηρίου όταν μετακινείστε μεταξύ των καθορισμένων περιοχών.Τα αντιδραστήρια και ο εξοπλισμός δεν πρέπει να μετακινούνται από μια βρώμικη περιοχή σε μια καθαρή περιοχή.Σε περίπτωση που προκύψει μια ακραία περίπτωση όπου ένα αντιδραστήριο ή ένα τμήμα του εξοπλισμού πρέπει να μετακινηθεί προς τα πίσω, πρέπει πρώτα να απολυμανθεί με 10% υποχλωριώδες νάτριο και στη συνέχεια να σκουπιστεί με αποστειρωμένο νερό.

Σημείωση

Το διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 10% πρέπει να παρασκευάζεται φρέσκο ​​καθημερινά.Όταν χρησιμοποιείται για απολύμανση, θα πρέπει να τηρείται ένας ελάχιστος χρόνος επαφής 10 λεπτών.
Εναλλακτικά, τα εμπορικά διαθέσιμα προϊόντα που έχουν επικυρωθεί ως επιφανειακά απολυμαντικά που καταστρέφουν το DNA μπορούν να χρησιμοποιηθούν εάν οι τοπικές συστάσεις ασφαλείας δεν επιτρέπουν τη χρήση υποχλωριώδους νατρίου ή εάν το υποχλωριώδες νάτριο δεν είναι κατάλληλο για την απολύμανση των μεταλλικών μερών του εξοπλισμού.

Στην ιδανική περίπτωση, το προσωπικό θα πρέπει να τηρεί το ήθος της ροής εργασίας μονής κατεύθυνσης και να μην επιστρέφει από βρώμικες περιοχές (μετά-PCR) σε καθαρούς χώρους (προ-PCR) την ίδια ημέρα.Ωστόσο, μπορεί να υπάρχουν περιπτώσεις που αυτό είναι αναπόφευκτο.Όταν προκύψει τέτοια περίσταση, το προσωπικό πρέπει να φροντίζει να πλένει καλά τα χέρια, να αλλάζει γάντια, να χρησιμοποιεί το καθορισμένο εργαστηριακό παλτό και να μην εισάγει ξανά εξοπλισμό που θέλει να βγάλει από το δωμάτιο, όπως βιβλία εργαστηρίου.Τέτοια μέτρα ελέγχου θα πρέπει να δίνονται έμφαση στην εκπαίδευση του προσωπικού σε μοριακές μεθόδους.

Μετά τη χρήση, οι χώροι των πάγκων θα πρέπει να καθαρίζονται με 10% υποχλωριώδες νάτριο (ακολουθούμενο από αποστειρωμένο νερό για την απομάκρυνση των υπολειμμάτων λευκαντικού), 70% αιθανόλη ή ένα επικυρωμένο εμπορικά διαθέσιμο απολυμαντικό που καταστρέφει το DNA.Ιδανικά, θα πρέπει να τοποθετούνται λαμπτήρες υπεριώδους (UV) για να επιτρέπουν την απολύμανση με ακτινοβολία.Ωστόσο, η χρήση λαμπτήρων υπεριώδους ακτινοβολίας θα πρέπει να περιορίζεται σε κλειστούς χώρους εργασίας, π.χ. ντουλάπια ασφαλείας, προκειμένου να περιοριστεί η έκθεση του προσωπικού του εργαστηρίου στην υπεριώδη ακτινοβολία.Τηρείτε τις οδηγίες του κατασκευαστή για τη φροντίδα, τον αερισμό και τον καθαρισμό των λαμπτήρων UV, προκειμένου να διασφαλίσετε ότι οι λαμπτήρες παραμένουν αποτελεσματικοί.

Εάν χρησιμοποιείται αιθανόλη 70% αντί για υποχλωριώδες νάτριο, θα χρειαστεί ακτινοβόληση με υπεριώδη ακτινοβολία για να ολοκληρωθεί η απολύμανση.
Μην καθαρίζετε τη δίνη και μην κάνετε φυγοκέντρηση με υποχλωριώδες νάτριο.Αντ' αυτού, σκουπίστε με αιθανόλη 70% και εκτεθείτε σε υπεριώδη ακτινοβολία ή χρησιμοποιήστε ένα εμπορικό απολυμαντικό που καταστρέφει το DNA.Για τυχόν διαρροές, επικοινωνήστε με τον κατασκευαστή για περαιτέρω συμβουλές καθαρισμού.Εάν οι οδηγίες του κατασκευαστή το επιτρέπουν, οι πιπέτες θα πρέπει να αποστειρώνονται τακτικά με αυτόκλειστο.Εάν οι πιπέτες δεν μπορούν να αποστειρωθούν σε αυτόκλειστο, θα πρέπει να αρκεί να τις καθαρίσετε με 10% υποχλωριώδες νάτριο (ακολουθούμενο από σχολαστικό σκούπισμα με αποστειρωμένο νερό) ή με ένα εμπορικό απολυμαντικό που καταστρέφει το DNA και στη συνέχεια έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία.

Ο καθαρισμός με υψηλού ποσοστού υποχλωριώδους νατρίου μπορεί τελικά να καταστρέψει τα πλαστικά και τα μέταλλα της πιπέτας, εάν γίνεται σε τακτική βάση.ελέγξτε πρώτα τις συστάσεις του κατασκευαστή.Όλος ο εξοπλισμός πρέπει να βαθμονομείται τακτικά σύμφωνα με το πρόγραμμα που συνιστά ο κατασκευαστής.Ένα καθορισμένο άτομο θα πρέπει να είναι υπεύθυνο για τη διασφάλιση της τήρησης του χρονοδιαγράμματος βαθμονόμησης, της τήρησης λεπτομερών αρχείων καταγραφής και των ετικετών σέρβις που εμφανίζονται καθαρά στον εξοπλισμό.

3. Συμβουλές χρήσης και καθαρισμού για τον καθορισμένο μοριακό χώρο

Pre-PCR: Κατανομή αντιδραστηρίων / προετοιμασία mastermix: Αυτός θα πρέπει να είναι ο πιο καθαρός από όλους τους χώρους που χρησιμοποιούνται για την προετοιμασία των μοριακών πειραμάτων και θα πρέπει ιδανικά να είναι ένας καθορισμένος θάλαμος στρωτής ροής εξοπλισμένος με φως UV.Δεν πρέπει να γίνεται χειρισμός δειγμάτων, εκχυλισμένων νουκλεϊκών οξέων και ενισχυμένων προϊόντων PCR σε αυτήν την περιοχή.Τα αντιδραστήρια ενίσχυσης θα πρέπει να φυλάσσονται σε καταψύκτη (ή ψυγείο, σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή) στον ίδιο καθορισμένο χώρο, ιδανικά δίπλα στο θάλαμο στρωτής ροής ή στην περιοχή προ-PCR.Τα γάντια πρέπει να αλλάζονται κάθε φορά κατά την είσοδο στην περιοχή προ-PCR ή στο θάλαμο στρωτής ροής.

Η περιοχή πριν από την PCR ή ο θάλαμος στρωτής ροής πρέπει να καθαρίζεται πριν και μετά τη χρήση ως εξής: Σκουπίστε όλα τα αντικείμενα στο ντουλάπι, π.χ. εμπορικό απολυμαντικό που καταστρέφει το DNA και αφήστε το να στεγνώσει.Σε περίπτωση κλειστού χώρου εργασίας, π.χ. θάλαμος στρωτής ροής, εκθέστε την κουκούλα σε υπεριώδη ακτινοβολία για 30 λεπτά.

Σημείωση

Μην εκθέτετε τα αντιδραστήρια σε υπεριώδη ακτινοβολία.Μετακινήστε τα στο ντουλάπι μόνο όταν είναι καθαρό.Εάν εκτελείτε PCR αντίστροφης μεταγραφής, μπορεί επίσης να είναι χρήσιμο να σκουπίσετε τις επιφάνειες και τον εξοπλισμό με ένα διάλυμα που διασπά τις RNases κατά την επαφή.Αυτό μπορεί να βοηθήσει στην αποφυγή ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων από την ενζυμική αποικοδόμηση του RNA.Μετά την απολύμανση και πριν από την προετοιμασία του mastermix, τα γάντια θα πρέπει να αλλάξουν άλλη μια φορά και στη συνέχεια το ντουλάπι είναι έτοιμο για χρήση.

Pre-PCR: Εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος/προσθήκη προτύπου:

Το νουκλεϊκό οξύ πρέπει να εξάγεται και να χειρίζεται σε μια δεύτερη καθορισμένη περιοχή, χρησιμοποιώντας ένα ξεχωριστό σετ πιπέτων, άκρες φίλτρων, σχάρες σωλήνων, φρέσκα γάντια, παλτό εργαστηρίου και άλλο εξοπλισμό. Αυτή η περιοχή προορίζεται επίσης για την προσθήκη προτύπων, χειριστηρίων και γραμμών τάσης στο σωλήνες ή πλάκες mastermix.Για να αποφευχθεί η μόλυνση των δειγμάτων νουκλεϊκών οξέων που έχουν εκχυλιστεί που αναλύονται, συνιστάται η αλλαγή γαντιών πριν από το χειρισμό θετικών μαρτύρων ή προτύπων και η χρήση ξεχωριστού σετ πιπέτων.Τα αντιδραστήρια PCR και τα ενισχυμένα προϊόντα δεν πρέπει να μεταφέρονται με πιπέτα σε αυτήν την περιοχή.Τα δείγματα πρέπει να φυλάσσονται σε καθορισμένα ψυγεία ή καταψύκτες στον ίδιο χώρο.Ο χώρος εργασίας του δείγματος θα πρέπει να καθαρίζεται με τον ίδιο τρόπο όπως ο χώρος του mastermix.

Post-PCR: Ενίσχυση και χειρισμός του ενισχυμένου προϊόντος

Αυτός ο καθορισμένος χώρος είναι για διεργασίες μετά την ενίσχυση και θα πρέπει να είναι φυσικά ξεχωριστός από τις περιοχές πριν από την PCR.Συνήθως περιέχει θερμοκυκλοποιητές και πλατφόρμες πραγματικού χρόνου και, ιδανικά, θα πρέπει να διαθέτει θάλαμο στρωτής ροής για την προσθήκη του προϊόντος PCR γύρου 1 στην αντίδραση γύρου 2, εάν εκτελείται ένθετη PCR.Τα αντιδραστήρια PCR και το εκχυλισμένο νουκλεϊκό οξύ δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται σε αυτήν την περιοχή, καθώς ο κίνδυνος μόλυνσης είναι υψηλός.Αυτός ο χώρος θα πρέπει να διαθέτει ξεχωριστό σετ γαντιών, εργαστηριακών παλτών, σχάρες για πιάτα και σωληνάρια, πιπέτες, άκρες φίλτρων, κάδους και άλλο εξοπλισμό.Οι σωλήνες πρέπει να φυγοκεντρηθούν πριν ανοίξουν.Ο χώρος εργασίας του δείγματος θα πρέπει να καθαρίζεται με τον ίδιο τρόπο όπως ο χώρος του mastermix.

Post-PCR: Ανάλυση προϊόντος

Αυτό το δωμάτιο προορίζεται για εξοπλισμό ανίχνευσης προϊόντων, π.χ. δεξαμενές ηλεκτροφόρησης γέλης, πακέτα ισχύος, μεταφραστή UV και σύστημα τεκμηρίωσης γέλης.Αυτός ο χώρος θα πρέπει να διαθέτει ξεχωριστά σετ γαντιών, εργαστηριακών παλτών, σχάρες για πιάτα και σωληνάρια, πιπέτες, άκρες φίλτρων, κάδους και άλλο εξοπλισμό.Δεν μπορούν να εισαχθούν άλλα αντιδραστήρια σε αυτήν την περιοχή, με εξαίρεση τη χρωστική φόρτωσης, τον μοριακό δείκτη και τη γέλη αγαρόζης και τα ρυθμιστικά συστατικά.Ο χώρος εργασίας του δείγματος θα πρέπει να καθαρίζεται με τον ίδιο τρόπο όπως ο χώρος του mastermix.

Σημαντική σημείωση

Ιδανικά, οι αίθουσες πριν από την PCR δεν θα πρέπει να εισέρχονται την ίδια ημέρα εάν έχουν ήδη πραγματοποιηθεί εργασίες στις αίθουσες μετά την PCR.Εάν αυτό είναι εντελώς αναπόφευκτο, βεβαιωθείτε ότι τα χέρια έχουν πλυθεί σχολαστικά και ότι φοριούνται συγκεκριμένα εργαστηριακά παλτά στα δωμάτια.Τα εργαστηριακά βιβλία και η γραφική εργασία δεν πρέπει να μεταφέρονται στις αίθουσες πριν από την PCR, εάν έχουν χρησιμοποιηθεί στις αίθουσες μετά την PCR.εάν είναι απαραίτητο, κάντε διπλότυπες εκτυπώσεις πρωτοκόλλων/δειγμάτων αναγνωριστικών κ.λπ.

4. Γενικές συμβουλές μοριακής βιολογίας

Χρησιμοποιήστε γάντια χωρίς πούδρα για να αποφύγετε την αναστολή της ανάλυσης.Η σωστή τεχνική πιπέτας είναι υψίστης σημασίας για τη μείωση της μόλυνσης.Η λανθασμένη μεταφορά με πιπέτα μπορεί να οδηγήσει σε πιτσίλισμα κατά τη διανομή υγρών και τη δημιουργία αερολυμάτων.Οι καλές πρακτικές για το σωστό σιφώνιο μπορούν να βρεθούν στους ακόλουθους συνδέσμους: Οδηγός Gilson για τη διοχέτευση με πιπέτα, βίντεο τεχνικής πιπέτας Anachem, Φυγοκεντρήστε τους σωλήνες πριν ανοίξετε και ανοίξτε τους προσεκτικά για να αποφύγετε το πιτσίλισμα.Κλείστε τους σωλήνες αμέσως μετά τη χρήση για να αποφύγετε την εισαγωγή ρύπων.

Όταν εκτελείτε πολλαπλές αντιδράσεις, προετοιμάστε ένα mastermix που περιέχει κοινά αντιδραστήρια (π.χ. νερό, dNTPs, ρυθμιστικό διάλυμα, εκκινητές και ένζυμο) για να ελαχιστοποιήσετε τον αριθμό των μεταφορών αντιδραστηρίων και να μειώσετε τον κίνδυνο μόλυνσης.Συνιστάται να ρυθμίσετε το mastermix σε πάγο ή κρύο μπλοκ.Η χρήση ενός ενζύμου Hot Start μπορεί να βοηθήσει στη μείωση της παραγωγής μη ειδικών προϊόντων.Προστατέψτε τα αντιδραστήρια που περιέχουν φθορίζοντες ανιχνευτές από το φως για να αποφύγετε την υποβάθμιση.

5. Εσωτερικοί έλεγχοι

Συμπεριλάβετε καλά χαρακτηρισμένους, επιβεβαιωμένους θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες, μαζί με έναν έλεγχο χωρίς πρότυπο σε όλες τις αντιδράσεις και μια τιτλοδοτημένη γραμμή τάσης πολλαπλών σημείων για ποσοτικές αντιδράσεις.Ο θετικός έλεγχος δεν πρέπει να είναι τόσο ισχυρός ώστε να δημιουργεί κίνδυνο μόλυνσης.Συμπεριλάβετε θετικούς και αρνητικούς ελέγχους εκχύλισης όταν εκτελείτε εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος.

Συνιστάται να αναρτώνται σαφείς οδηγίες σε κάθε μία από τις περιοχές, ώστε οι χρήστες να γνωρίζουν τους κανόνες συμπεριφοράς.Τα διαγνωστικά εργαστήρια που ανιχνεύουν πολύ χαμηλά επίπεδα DNA ή RNA σε κλινικά δείγματα μπορεί να θελήσουν να υιοθετήσουν το πρόσθετο μέτρο ασφαλείας της ύπαρξης χωριστών συστημάτων διαχείρισης αέρα με ελαφρώς θετική πίεση αέρα στα δωμάτια πριν από την PCR και ελαφρώς αρνητική πίεση αέρα στα δωμάτια μετά την PCR.

Τέλος, η ανάπτυξη ενός σχεδίου διασφάλισης ποιότητας (QA) είναι χρήσιμη.Ένα τέτοιο σχέδιο θα πρέπει να περιλαμβάνει λίστες βασικών αποθεμάτων αντιδραστηρίων και αποθεμάτων εργασίας, κανόνες για την αποθήκευση κιτ και αντιδραστηρίων, αναφορά αποτελεσμάτων ελέγχου, προγράμματα εκπαίδευσης προσωπικού, αλγόριθμους αντιμετώπισης προβλημάτων και διορθωτικές ενέργειες όταν χρειάζεται.

6. Βιβλιογραφία

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Κεφάλαιο 3: Δημιουργία εργαστηρίου qPCR.Ένα έγγραφο καθοδήγησης για τη δοκιμή υδάτων αναψυχής με χρήση της μεθόδου USEPA qPCR 1611. Lansing- State University του Μίσιγκαν.

Δημόσια Υγεία Αγγλία, NHS.Πρότυπα του ΗΒ για μικροβιολογικές έρευνες: Ορθή εργαστηριακή πρακτική κατά την εκτέλεση αναλύσεων μοριακής ενίσχυσης).Καθοδήγηση ποιότητας.2013; 4 (4): 1–15.

Mifflin T. Δημιουργία εργαστηρίου PCR.Cold Spring Harb Protoc.2007; 7.

Schroeder S 2013. Συντήρηση ρουτίνας φυγοκεντρητών: καθαρισμός, συντήρηση και απολύμανση φυγοκεντρητών, ρότορων και προσαρμογέων (Λευκή Βίβλος Νο. 14).Αμβούργο: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) για μοριακές δοκιμές που χρησιμοποιούνται σε διαγνωστικά εργαστήρια, Στο: Akyar I, συντάκτης.Ευρύ φάσμα ποιοτικού ελέγχου.Ριέκα, Κροατία: Intech;2011: 29–52.