Molekulare Nachweismethoden sind in der Lage, durch die Amplifikation von Spurenmengen in Proben ein großes Volumen an Nukleinsäure zu produzieren.Dies ist zwar vorteilhaft für die Ermöglichung einer empfindlichen Detektion, birgt aber auch die Möglichkeit einer Kontamination durch die Ausbreitung von Amplifikationsaerosolen in der Laborumgebung.Bei der Durchführung von Experimenten können Maßnahmen ergriffen werden, um eine Kontamination von Reagenzien, Laborgeräten und Laborflächen zu vermeiden, da eine solche Kontamination zu falsch positiven (oder falsch negativen) Ergebnissen führen kann.

Um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination zu verringern, sollte jederzeit eine gute Laborpraxis praktiziert werden.Konkret sollten Vorkehrungen hinsichtlich folgender Punkte getroffen werden:

1. Umgang mit Reagenzien
2. Organisation von Arbeitsplatz und Ausrüstung
3. Nutzungs- und Reinigungshinweise für den vorgesehenen Molekülraum
4. Allgemeine molekularbiologische Ratschläge
5. Interne Kontrollen
6. Bibliographie

1. Umgang mit Reagenzien

Zentrifugieren Sie die Reagenzröhrchen vor dem Öffnen kurz, um die Entstehung von Aerosolen zu vermeiden.Aliquotieren Sie Reagenzien, um mehrfaches Einfrieren und Auftauen und die Kontamination von Master-Beständen zu vermeiden.Beschriften und datieren Sie alle Reagenzien und Reaktionsröhrchen deutlich und führen Sie Protokolle über die in allen Experimenten verwendeten Reagenzienchargen und Chargennummern.Pipettieren Sie alle Reagenzien und Proben mit Filterspitzen.Vor dem Kauf empfiehlt es sich, beim Hersteller zu klären, ob die Filterspitzen für die zu verwendende Pipettenmarke geeignet sind.

2. Organisation von Arbeitsplatz und Ausrüstung

Der Arbeitsbereich sollte so organisiert sein, dass der Arbeitsfluss in eine Richtung erfolgt, von sauberen Bereichen (vor der PCR) zu schmutzigen Bereichen (nach der PCR).Die folgenden allgemeinen Vorsichtsmaßnahmen tragen dazu bei, das Risiko einer Kontamination zu verringern.Verfügen Sie über separate ausgewiesene Räume oder zumindest physisch getrennte Bereiche für: Mastermix-Vorbereitung, Nukleinsäureextraktion und DNA-Template-Zugabe, Amplifikation und Handhabung des amplifizierten Produkts sowie Produktanalyse, z. B. Gelelektrophorese.

In manchen Umgebungen ist es schwierig, vier separate Räume zu haben.Eine mögliche, aber weniger wünschenswerte Option besteht darin, die Mastermix-Zubereitung in einem Sicherheitsbereich, z. B. einem Laminar-Flow-Schrank, durchzuführen.Im Falle der Nested-PCR-Amplifikation sollte die Vorbereitung des Mastermixes für die Zweitrundenreaktion im „sauberen“ Bereich für die Mastermix-Vorbereitung erfolgen, die Beimpfung mit dem primären PCR-Produkt sollte jedoch möglichst im Amplifikationsraum erfolgen in einem speziellen Sicherheitsbereich (z. B. einem Laminar-Flow-Schrank).

Jeder Raum/Bereich benötigt einen separaten Satz deutlich gekennzeichneter Pipetten, Filterspitzen, Röhrchenständer, Vortexer, Zentrifugen (falls relevant), Stifte, generische Laborreagenzien, Laborkittel und Kartons mit Handschuhen, die an ihren jeweiligen Arbeitsplätzen verbleiben.Beim Bewegen zwischen den ausgewiesenen Bereichen müssen die Hände gewaschen und Handschuhe und Laborkittel gewechselt werden.Reagenzien und Geräte sollten nicht von einem schmutzigen Bereich in einen sauberen Bereich gebracht werden.Sollte ein Extremfall auftreten, bei dem ein Reagenz oder ein Gerät rückwärts bewegt werden muss, muss es zunächst mit 10 %iger Natriumhypochloritlösung dekontaminiert und anschließend mit sterilem Wasser abgewischt werden.

Notiz

Die 10 %ige Natriumhypochloritlösung muss täglich frisch angesetzt werden.Bei der Dekontamination sollte eine Mindesteinwirkzeit von 10 Minuten eingehalten werden.
Alternativ können im Handel erhältliche Produkte verwendet werden, die als DNA-zerstörende Oberflächendekontaminationsmittel validiert sind, wenn örtliche Sicherheitsempfehlungen die Verwendung von Natriumhypochlorit nicht zulassen oder wenn Natriumhypochlorit nicht für die Dekontamination von Metallteilen von Geräten geeignet ist.

Im Idealfall sollte sich das Personal an den unidirektionalen Arbeitsablauf halten und nicht am selben Tag von schmutzigen Bereichen (nach der PCR) zurück in saubere Bereiche (vor der PCR) gehen.Es kann jedoch vorkommen, dass dies unvermeidbar ist.Wenn eine solche Gelegenheit eintritt, muss das Personal darauf achten, gründlich die Hände zu waschen, die Handschuhe zu wechseln, den dafür vorgesehenen Laborkittel zu tragen und keine Geräte mitzubringen, die es wieder aus dem Raum mitnehmen möchte, wie z. B. Laborbücher.Solche Kontrollmaßnahmen sollten bei der Schulung des Personals zu molekularen Methoden hervorgehoben werden.

Nach der Verwendung sollten die Arbeitsflächen mit 10 % Natriumhypochlorit (gefolgt von sterilem Wasser zur Entfernung restlicher Bleichmittel), 70 % Ethanol oder einem validierten, im Handel erhältlichen DNA-zerstörenden Dekontaminationsmittel gereinigt werden.Idealerweise sollten UV-Lampen eingebaut werden, um eine Dekontamination durch Bestrahlung zu ermöglichen.Allerdings sollte der Einsatz von UV-Lampen auf geschlossene Arbeitsbereiche, z. B. Sicherheitsschränke, beschränkt werden, um die UV-Belastung des Laborpersonals zu begrenzen.Bitte befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zur Pflege, Belüftung und Reinigung von UV-Lampen, um sicherzustellen, dass die Lampen weiterhin wirksam sind.

Bei Verwendung von 70 %igem Ethanol anstelle von Natriumhypochlorit ist eine Bestrahlung mit UV-Licht erforderlich, um die Dekontamination abzuschließen.
Reinigen Sie den Vortex und die Zentrifuge nicht mit Natriumhypochlorit;Stattdessen mit 70 %igem Ethanol abwischen und UV-Licht aussetzen oder ein handelsübliches DNA-zerstörendes Dekontaminationsmittel verwenden.Wenden Sie sich bei verschütteten Flüssigkeiten an den Hersteller, um weitere Reinigungshinweise zu erhalten.Wenn die Herstelleranweisungen dies zulassen, sollten Pipetten routinemäßig im Autoklaven sterilisiert werden.Wenn Pipetten nicht autoklavierbar sind, sollte es ausreichen, sie mit 10 % Natriumhypochlorit (gefolgt von einem gründlichen Abwischen mit sterilem Wasser) oder mit einem handelsüblichen DNA-zerstörenden Dekontaminationsmittel und anschließender UV-Bestrahlung zu reinigen.

Bei regelmäßiger Reinigung mit hochprozentigem Natriumhypochlorit können Kunststoffe und Metalle der Pipette beschädigt werden.Überprüfen Sie zunächst die Empfehlungen des Herstellers.Alle Geräte müssen regelmäßig gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Zeitplan kalibriert werden.Eine bestimmte Person sollte dafür verantwortlich sein, sicherzustellen, dass der Kalibrierungsplan eingehalten wird, detaillierte Protokolle geführt werden und Serviceetiketten deutlich auf den Geräten angebracht sind.

3. Nutzungs- und Reinigungshinweise für den vorgesehenen Molekülraum

Vor-PCR: Aliquotierung der Reagenzien/Mastermix-Vorbereitung: Dies sollte der sauberste aller Räume sein, die für die Vorbereitung molekularer Experimente verwendet werden, und idealerweise ein speziell dafür vorgesehener Laminar-Flow-Schrank, der mit UV-Licht ausgestattet ist.Proben, extrahierte Nukleinsäure und amplifizierte PCR-Produkte dürfen in diesem Bereich nicht gehandhabt werden.Amplifikationsreagenzien sollten in einem Gefrierschrank (oder Kühlschrank, je nach Herstellerempfehlung) im selben dafür vorgesehenen Raum aufbewahrt werden, idealerweise neben dem Laminar-Flow-Schrank oder dem Pre-PCR-Bereich.Die Handschuhe sollten jedes Mal beim Betreten des Pre-PCR-Bereichs oder des Laminar-Flow-Kabinetts gewechselt werden.

Der Pre-PCR-Bereich oder der Laminar-Flow-Schrank sollte vor und nach der Verwendung wie folgt gereinigt werden: Wischen Sie alle Gegenstände im Schrank, z. B. Pipetten, Spitzenboxen, Vortex, Zentrifuge, Röhrchenständer, Stifte usw., mit 70 %igem Ethanol oder a ab handelsübliches DNA-zerstörendes Dekontaminationsmittel auftragen und trocknen lassen.Bei einem geschlossenen Arbeitsbereich, z. B. einem Laminar-Flow-Schrank, setzen Sie die Haube 30 Minuten lang UV-Licht aus.

Notiz

Setzen Sie die Reagenzien keinem UV-Licht aus;Stellen Sie sie erst dann in den Schrank, wenn dieser sauber ist.Bei der Durchführung einer Reverse-Transkriptions-PCR kann es außerdem hilfreich sein, Oberflächen und Geräte mit einer Lösung abzuwischen, die RNasen bei Kontakt abbaut.Dies kann dazu beitragen, falsch-negative Ergebnisse durch den enzymatischen Abbau von RNA zu vermeiden.Nach der Dekontamination und vor der Zubereitung des Mastermixes sollten die Handschuhe noch einmal gewechselt werden, dann ist der Schrank einsatzbereit.

Prä-PCR: Nukleinsäureextraktion/Template-Zugabe:

Nukleinsäure muss in einem zweiten dafür vorgesehenen Bereich extrahiert und gehandhabt werden, wobei ein separater Satz Pipetten, Filterspitzen, Röhrchenständer, frische Handschuhe, Laborkittel und andere Geräte verwendet werden. Dieser Bereich dient auch dem Hinzufügen von Vorlagen, Kontrollen und Trendlinien Mastermix-Röhrchen oder -Platten.Um eine Kontamination der extrahierten Nukleinsäureproben, die analysiert werden, zu vermeiden, wird empfohlen, vor der Handhabung von Positivkontrollen oder Standards die Handschuhe zu wechseln und einen separaten Satz Pipetten zu verwenden.PCR-Reagenzien und amplifizierte Produkte dürfen in diesem Bereich nicht pipettiert werden.Die Proben sollten in dafür vorgesehenen Kühl- oder Gefrierschränken im selben Bereich aufbewahrt werden.Der Probenarbeitsbereich sollte auf die gleiche Weise wie der Mastermix-Bereich gereinigt werden.

Post-PCR: Amplifikation und Handhabung des amplifizierten Produkts

Dieser ausgewiesene Raum ist für Prozesse nach der Amplifikation vorgesehen und sollte physisch von den Bereichen vor der PCR getrennt sein.Es enthält normalerweise Thermocycler und Echtzeitplattformen und sollte idealerweise über einen Laminar-Flow-Schrank zum Hinzufügen des PCR-Produkts der ersten Runde zur Reaktion der zweiten Runde verfügen, wenn eine verschachtelte PCR durchgeführt wird.PCR-Reagenzien und extrahierte Nukleinsäure dürfen in diesem Bereich nicht gehandhabt werden, da die Gefahr einer Kontamination hoch ist.In diesem Bereich sollte ein separater Satz Handschuhe, Laborkittel, Platten- und Röhrchenständer, Pipetten, Filterspitzen, Behälter und andere Geräte vorhanden sein.Röhrchen müssen vor dem Öffnen zentrifugiert werden.Der Probenarbeitsbereich sollte auf die gleiche Weise wie der Mastermix-Bereich gereinigt werden.

Post-PCR: Produktanalyse

Dieser Raum ist für Produkterkennungsgeräte vorgesehen, z. B. Gelelektrophoresetanks, Netzteile, UV-Transilluminator und das Geldokumentationssystem.In diesem Bereich sollten separate Sätze von Handschuhen, Laborkitteln, Platten- und Röhrchenständern, Pipetten, Filterspitzen, Behältern und anderen Geräten vorhanden sein.Es dürfen keine anderen Reagenzien in diesen Bereich gebracht werden, mit Ausnahme von Ladefarbstoff, molekularem Marker und Agarosegel sowie Pufferkomponenten.Der Probenarbeitsbereich sollte auf die gleiche Weise wie der Mastermix-Bereich gereinigt werden.

Wichtiger Hinweis

Idealerweise sollten die Pre-PCR-Räume nicht am selben Tag betreten werden, wenn bereits Arbeiten in den Post-PCR-Räumen durchgeführt wurden.Sollte dies völlig unvermeidbar sein, achten Sie darauf, dass Sie sich vorher gründlich die Hände waschen und dass in den Räumen spezielle Laborkittel getragen werden.Laborbücher und Unterlagen dürfen nicht in die Pre-PCR-Räume mitgenommen werden, wenn sie in den Post-PCR-Räumen verwendet wurden;Erstellen Sie bei Bedarf doppelte Ausdrucke von Protokollen/Proben-IDs usw.

4. Allgemeine molekularbiologische Ratschläge

Verwenden Sie puderfreie Handschuhe, um eine Hemmung des Tests zu vermeiden.Die richtige Pipettiertechnik ist für die Reduzierung von Kontaminationen von größter Bedeutung.Durch unsachgemäßes Pipettieren kann es beim Dosieren von Flüssigkeiten zu Spritzern und zur Bildung von Aerosolen kommen.Gute Praktiken für korrektes Pipettieren finden Sie unter den folgenden Links: Gilson-Leitfaden zum Pipettieren, Videos zur Anachem-Pipettiertechnik, Zentrifugenröhrchen vor dem Öffnen und vorsichtig öffnen, um Spritzer zu vermeiden.Verschließen Sie die Röhrchen sofort nach Gebrauch, um das Eindringen von Verunreinigungen zu vermeiden.

Wenn Sie mehrere Reaktionen durchführen, bereiten Sie einen Mastermix mit gängigen Reagenzien (z. B. Wasser, dNTPs, Puffer, Primer und Enzym) vor, um die Anzahl der Reagenztransfers zu minimieren und die Gefahr einer Kontamination zu verringern.Es empfiehlt sich, den Mastermix auf Eis oder einem Kühlblock anzusetzen.Der Einsatz eines Hot-Start-Enzyms kann dazu beitragen, die Produktion unspezifischer Produkte zu reduzieren.Schützen Sie Reagenzien mit Fluoreszenzsonden vor Licht, um eine Zersetzung zu vermeiden.

5. Interne Kontrollen

Beziehen Sie gut charakterisierte, bestätigte Positiv- und Negativkontrollen sowie eine Kontrolle ohne Vorlage in allen Reaktionen und eine an mehreren Punkten titrierte Trendlinie für quantitative Reaktionen ein.Die Positivkontrolle sollte nicht so stark sein, dass sie ein Kontaminationsrisiko darstellt.Berücksichtigen Sie bei der Nukleinsäureextraktion positive und negative Extraktionskontrollen.

Es wird empfohlen, in jedem Bereich klare Anweisungen anzubringen, damit die Benutzer über die Verhaltensregeln informiert sind.Diagnoselabore, die sehr geringe DNA- oder RNA-Werte in klinischen Proben feststellen, möchten möglicherweise die zusätzliche Sicherheitsmaßnahme übernehmen und über separate Lüftungssysteme mit leicht positivem Luftdruck in den Räumen vor der PCR und leicht negativem Luftdruck in den Räumen nach der PCR verfügen.

Schließlich ist die Entwicklung eines Qualitätssicherungsplans (QS) hilfreich.Ein solcher Plan sollte Listen der Stamm- und Arbeitsbestände der Reagenzien, Regeln für die Lagerung von Kits und Reagenzien, die Meldung von Kontrollergebnissen, Schulungsprogramme für das Personal, Algorithmen zur Fehlerbehebung und bei Bedarf Abhilfemaßnahmen umfassen.

6. Bibliographie

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapitel 3: Einrichten eines qPCR-Labors.Ein Leitfaden zum Testen von Freizeitgewässern mit der USEPA qPCR-Methode 1611. Lansing – Michigan State University.

Public Health England, NHS.Britische Standards für mikrobiologische Untersuchungen: Gute Laborpraxis bei der Durchführung molekularer Amplifikationstests.Qualitätsberatung.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Einrichten eines PCR-Labors.Cold Spring Harb Protokoll.2007;7.

Schroeder S 2013. Routinewartung von Zentrifugen: Reinigung, Wartung und Desinfektion von Zentrifugen, Rotoren und Adaptern (Whitepaper Nr. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Gute klinische Laborpraxis (GCLP) für molekularbasierte Tests in diagnostischen Labors, In: Akyar I, Herausgeber.Breites Spektrum an Qualitätskontrolle.Rijeka, Kroatien: Intech;2011: 29–52.