Molekylær detektionsmetoder har evnen til at producere et stort volumen nukleinsyre gennem amplifikation af spormængder fundet i prøver.Selvom dette er fordelagtigt for at muliggøre følsom detektion, introducerer det også muligheden for kontaminering gennem spredning af amplifikationsaerosoler i laboratoriemiljøet.Når der udføres eksperimenter, kan der træffes foranstaltninger for at undgå kontaminering af reagenser, laboratorieudstyr og bænkplads, da en sådan forurening kan generere falsk-positive (eller falsk-negative) resultater.

For at hjælpe med at reducere sandsynligheden for kontaminering bør god laboratoriepraksis til enhver tid udøves.Specifikt skal der tages forholdsregler vedrørende følgende punkter:

1. Håndtering af reagenser
2. Organisering af arbejdsrum og udstyr
3. Brug og rengøringsråd for det udpegede molekylære rum
4. Generel molekylærbiologisk rådgivning
5. Interne kontroller
6. Litteraturliste

1. Håndtering af reagenser

Centrifuger reagensrørene kort før åbning for at undgå dannelse af aerosoler.Alikvoter reagenser for at undgå flere fryse-optøninger og kontaminering af stamlagre.Mærk og dater tydeligt alle reagens- og reaktionsglas, og vedligehold logfiler over reagenslot- og batchnumre, der er brugt i alle eksperimenter.Pipetter alle reagenser og prøver ved hjælp af filterspidser.Før køb, er det tilrådeligt at bekræfte med producenten, at filterspidserne passer til den pipette, der skal bruges.

2. Organisering af arbejdsrum og udstyr

Arbejdsområdet bør organiseres for at sikre, at arbejdsstrømmen foregår i én retning, fra rene områder (præ-PCR) til snavsede områder (post-PCR).Følgende generelle forholdsregler hjælper med at reducere risikoen for kontaminering.Hav separate udpegede lokaler, eller som minimum fysisk adskilte områder, til: mastermix-fremstilling, nukleinsyreekstraktion og DNA-skabelontilsætning, amplifikation og håndtering af amplificeret produkt og produktanalyse, f.eks. gelelektroforese.

I nogle omgivelser er det svært at have 4 separate rum.En mulig, men mindre ønskværdig mulighed er at udføre mastermix-forberedelsen i et indeslutningsområde, f.eks. et laminært flow-skab.I tilfælde af nestet PCR-amplifikation bør klargøringen af ​​mastermixen til anden runde reaktion forberedes i det 'rene' område til mastermix-fremstilling, men podningen med det primære PCR-produkt skal foretages i amplifikationsrummet, og hvis muligt. i et dedikeret indeslutningsområde (f.eks. et laminar flow kabinet).

Hvert rum/område har brug for et separat sæt tydeligt mærkede pipetter, filterspidser, rørstativer, hvirvler, centrifuger (hvis det er relevant), penne, generiske laboratoriereagenser, laboratoriefrakker og kasser med handsker, der forbliver på deres respektive arbejdsstationer.Hænder skal vaskes og handsker og laboratoriefrakker skiftes, når man bevæger sig mellem de udpegede områder.Reagenser og udstyr bør ikke flyttes fra et snavset område til et rent område.Skulle der opstå et ekstremt tilfælde, hvor et reagens eller et stykke udstyr skal flyttes baglæns, skal det først dekontamineres med 10 % natriumhypochlorit, efterfulgt af en aftørring med sterilt vand.

Bemærk

10 % natriumhypochloritopløsningen skal tilberedes frisk dagligt.Ved brug til dekontaminering skal en minimum kontakttid på 10 minutter overholdes.
Alternativt kan kommercielt tilgængelige produkter, der er valideret som DNA-ødelæggende overfladedekontaminanter, anvendes, hvis lokale sikkerhedsanbefalinger ikke tillader brugen af ​​natriumhypochlorit, eller hvis natriumhypochlorit ikke er egnet til at dekontaminere udstyrs metaldele.

Ideelt set bør personalet overholde den ensrettede arbejdsflow-etos og ikke gå fra snavsede områder (post-PCR) tilbage til rene områder (pre-PCR) samme dag.Der kan dog være tilfælde, hvor dette er uundgåeligt.Når en sådan lejlighed opstår, skal personalet sørge for grundigt at vaske hænder, skifte handsker, bruge den udpegede laboratoriefrakke og ikke indføre noget udstyr, som de ønsker at tage ud af lokalet igen, såsom laboratoriebøger.Sådanne kontrolforanstaltninger bør fremhæves i personaleuddannelsen i molekylære metoder.

Efter brug skal bænkpladser rengøres med 10 % natriumhypochlorit (efterfulgt af sterilt vand for at fjerne resterende blegemiddel), 70 % ethanol eller en valideret kommercielt tilgængelig DNA-ødelæggende dekontaminant.Ideelt set bør der monteres ultraviolette (UV) lamper for at muliggøre dekontaminering ved bestråling.Dog bør brugen af ​​UV-lamper begrænses til lukkede arbejdsområder, fx sikkerhedsskabe, for at begrænse laboratoriepersonalets UV-eksponering.Overhold venligst producentens instruktioner for UV-lampepleje, ventilation og rengøring for at sikre, at lamperne forbliver effektive.

Hvis der anvendes 70 % ethanol i stedet for natriumhypochlorit, vil bestråling med UV-lys være nødvendig for at fuldføre dekontamineringen.
Rengør ikke vortexen og centrifuger ikke med natriumhypochlorit;Tør i stedet af med 70 % ethanol og udsæt for UV-lys, eller brug en kommerciel DNA-ødelæggende dekontaminant.For spild, kontakt producenten for yderligere rengøringsråd.Hvis producentens instruktioner tillader det, bør pipetter rutinemæssigt steriliseres i autoklave.Hvis pipetter ikke kan autoklaveres, bør det være tilstrækkeligt at rense dem med 10% natriumhypochlorit (efterfulgt af en grundig aftørring med sterilt vand) eller med en kommerciel DNA-ødelæggende dekontaminant efterfulgt af UV-eksponering.

Rengøring med højprocent natriumhypochlorit kan i sidste ende beskadige pipetteplast og metaller, hvis det udføres regelmæssigt;tjek først anbefalingerne fra producenten.Alt udstyr skal kalibreres regelmæssigt i henhold til producentens anbefalede tidsplan.En udpeget person bør være ansvarlig for at sikre, at kalibreringsskemaet overholdes, at detaljerede logfiler vedligeholdes, og at serviceetiketter er tydeligt vist på udstyret.

3. Brug og rengøringsråd for det udpegede molekylære rum

Præ-PCR: Reagens-alikvotering / mastermix-forberedelse: Dette bør være det reneste af alle rum, der bruges til forberedelse af molekylære eksperimenter og bør ideelt set være et udpeget laminært flow-kabinet udstyret med et UV-lys.Prøver, ekstraheret nukleinsyre og amplificerede PCR-produkter må ikke håndteres i dette område.Amplifikationsreagenser bør opbevares i en fryser (eller køleskab, i henhold til producentens anbefalinger) i det samme udpegede rum, ideelt ved siden af ​​laminar flow-kabinettet eller præ-PCR-området.Handsker bør skiftes hver gang, når de går ind i præ-PCR-området eller laminar flow-kabinettet.

Pre-PCR-området eller laminar flow-kabinettet skal rengøres før og efter brug som følger: Tør alle genstande i kabinettet af, f.eks. pipetter, tipbokse, vortex, centrifuge, rørstativer, penne osv. med 70 % ethanol eller en kommercielt DNA-ødelæggende dekontaminant, og lad det tørre.I tilfælde af et lukket arbejdsområde, f.eks. et laminært flow-skab, skal emhætten udsættes for UV-lys i 30 minutter.

Bemærk

Udsæt ikke reagenser for UV-lys;flyt dem først ind i skabet, når det er rent.Hvis du udfører omvendt transkriptions-PCR, kan det også være nyttigt at tørre overflader og udstyr af med en opløsning, der nedbryder RNaser ved kontakt.Dette kan hjælpe med at undgå falsk-negative resultater fra enzymnedbrydning af RNA.Efter dekontaminering og før klargøring af mastermixet skal handsker skiftes endnu en gang, og så er skabet klar til brug.

Præ-PCR: Nukleinsyreekstraktion/skabelontilsætning:

Nukleinsyre skal udvindes og håndteres i et andet udpeget område ved hjælp af et separat sæt pipetter, filterspidser, rørstativer, friske handsker, laboratoriefrakker og andet udstyr. Dette område er også til tilføjelse af skabelon, kontroller og trendlinjer til mastermix rør eller plader.For at undgå kontaminering af de ekstraherede nukleinsyreprøver, der analyseres, anbefales det at skifte handsker før håndtering af positive kontroller eller standarder og at bruge et separat sæt pipetter.PCR-reagenser og amplificerede produkter må ikke pipetteres i dette område.Prøver bør opbevares i udpegede køleskabe eller frysere i samme område.Prøvearbejdsområdet skal rengøres på samme måde som mastermix-rummet.

Post-PCR: Amplifikation og håndtering af det amplificerede produkt

Dette udpegede rum er til post-amplifikationsprocesser og bør være fysisk adskilt fra præ-PCR-områderne.Det indeholder normalt termocyclere og realtidsplatforme og bør ideelt set have et laminært flow-kabinet til at tilføje runde 1 PCR-produktet til runde 2-reaktionen, hvis indlejret PCR udføres.PCR-reagenser og ekstraheret nukleinsyre må ikke håndteres i dette område, da risikoen for kontaminering er høj.Dette område skal have et separat sæt handsker, laboratoriefrakker, plade- og rørstativer, pipetter, filterspidser, beholdere og andet udstyr.Rørene skal centrifugeres før åbning.Prøvearbejdsområdet skal rengøres på samme måde som mastermix-rummet.

Post-PCR: Produktanalyse

Dette rum er til produktdetektionsudstyr, f.eks. gelelektroforesetanke, strømpakker, UV-transilluminator og geldokumentationssystemet.Dette område skal have separate sæt handsker, laboratoriefrakker, plade- og rørstativer, pipetter, filterspidser, beholdere og andet udstyr.Ingen andre reagenser kan bringes ind i dette område, undtagen ladningsfarve, molekylær markør og agarosegel og bufferkomponenter.Prøvearbejdsområdet skal rengøres på samme måde som mastermix-rummet.

Vigtig note

Ideelt set bør præ-PCR-rummene ikke betrædes samme dag, hvis der allerede er udført arbejde i post-PCR-rummene.Hvis dette er helt uundgåeligt, skal du sørge for, at hænderne først vaskes grundigt, og at der bæres specifikke laboratoriefrakker i rummene.Laboratoriebøger og papirarbejde må ikke tages med ind i præ-PCR-rummene, hvis de har været brugt i post-PCR-rummene;om nødvendigt tage duplikatudskrifter af protokoller/prøve-ID'er mv.

4. Generel molekylærbiologisk rådgivning

Brug pudderfri handsker for at undgå assayhæmning.Korrekt pipetteringsteknik er altafgørende for at reducere forurening.Forkert pipettering kan resultere i sprøjt ved dispensering af væsker og dannelse af aerosoler.God praksis for korrekt pipettering kan findes på følgende links: Gilson guide til pipettering, Anachem pipettering teknik videoer, Centrifuger rør før åbning, og åbn dem forsigtigt for at undgå sprøjt.Luk rørene umiddelbart efter brug for at undgå indtrængen af ​​forurenende stoffer.

Når du udfører flere reaktioner, skal du forberede en mastermix indeholdende almindelige reagenser (f.eks. vand, dNTP'er, buffer, primere og enzym) for at minimere antallet af reagensoverførsler og reducere truslen om kontaminering.Det anbefales at sætte mastermixet op på is eller en kold blok.Brug af et Hot Start-enzym kan være med til at reducere produktionen af ​​ikke-specifikke produkter.Beskyt reagenser indeholdende fluorescerende prober mod lys for at undgå nedbrydning.

5. Interne kontroller

Inkluder velkarakteriserede, bekræftede positive og negative kontroller sammen med en kontrol uden skabelon i alle reaktioner og en flerpunktstitreret trendlinje for kvantitative reaktioner.Den positive kontrol bør ikke være så stærk, at den udgør en forureningsrisiko.Medtag positive og negative ekstraktionskontroller, når du udfører nukleinsyreekstraktion.

Det anbefales, at der opslås tydelige instruktioner på hvert af områderne, så brugerne er opmærksomme på adfærdsregler.Diagnostiske laboratorier, der detekterer meget lave niveauer af DNA eller RNA i kliniske prøver, vil måske bruge den ekstra sikkerhedsforanstaltning med separate luftbehandlingssystemer med let positivt lufttryk i præ-PCR-rummene og let negativt lufttryk i post-PCR-rummene.

Endelig er det nyttigt at udvikle en kvalitetssikringsplan (QA).En sådan plan bør omfatte lister over reagensmasterlagre og arbejdslagre, regler for opbevaring af kits og reagenser, rapportering af kontrolresultater, personaleuddannelsesprogrammer, fejlfindingsalgoritmer og afhjælpende handlinger, når det er nødvendigt.

6. Litteraturliste

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapitel 3: Opsætning af et qPCR-laboratorium.Et vejledningsdokument til afprøvning af rekreativt vand ved hjælp af USEPA qPCR-metode 1611. Lansing- Michigan State University.

Folkesundhed England, NHS.UK standarder for mikrobiologiske undersøgelser: god laboratoriepraksis ved udførelse af molekylære amplifikationsassays).Kvalitetsvejledning.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Opsætning af et PCR-laboratorium.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Rutinemæssig vedligeholdelse af centrifuger: rengøring, vedligeholdelse og desinfektion af centrifuger, rotorer og adaptere (Hvidbog nr. 14).Hamborg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) for molekylærbaserede tests brugt i diagnostiske laboratorier, I: Akyar I, redaktør.Bredt spektrum af kvalitetskontrol.Rijeka, Kroatien: Intech;2011: 29–52.