Mae gan ddulliau canfod moleciwlaidd y gallu i gynhyrchu cyfaint mawr o asid niwclëig trwy ymhelaethu ar feintiau hybrin a geir mewn samplau.Er bod hyn yn fuddiol ar gyfer galluogi canfod sensitif, mae hefyd yn cyflwyno'r posibilrwydd o halogiad trwy wasgaru erosolau chwyddo yn amgylchedd y labordy.Wrth gynnal arbrofion, gellir cymryd mesurau i osgoi halogi adweithyddion, offer labordy a gofod mainc, gan y gallai halogiad o'r fath gynhyrchu canlyniadau ffug-bositif (neu ffug-negyddol).

Er mwyn helpu i leihau'r tebygolrwydd o halogiad, dylid arfer Arfer Labordy Da bob amser.Yn benodol, dylid cymryd rhagofalon ynghylch y pwyntiau canlynol:

1. Trin adweithyddion
2. Trefnu gweithleoedd ac offer
3. Cyngor ar ddefnyddio a glanhau ar gyfer y gofod moleciwlaidd dynodedig
4. Cyngor cyffredinol ar fioleg foleciwlaidd
5. Rheolaethau mewnol
6. Llyfryddiaeth

1. Trin adweithyddion

Yn fyr tiwbiau adweithydd centrifuge cyn agor er mwyn osgoi cynhyrchu aerosolau.Aliquot adweithyddion i osgoi rhewi-dadmer lluosog a halogi stociau meistr.Labelwch a dyddiwch yr holl adweithyddion a thiwbiau adwaith yn glir a chadwch logiau o nifer yr adweithyddion a'r swp-rifau a ddefnyddiwyd ym mhob arbrawf.Pibed pob adweithydd a sampl gan ddefnyddio awgrymiadau hidlo.Cyn prynu, fe'ch cynghorir i gadarnhau gyda'r gwneuthurwr bod yr awgrymiadau hidlo yn cyd-fynd â'r brand pibed i'w ddefnyddio.

2. Trefnu gweithleoedd ac offer

Dylid trefnu mannau gwaith i sicrhau bod llif y gwaith yn digwydd i un cyfeiriad, o ardaloedd glân (cyn-PCR) i ardaloedd budr (ar ôl PCR).Bydd y rhagofalon cyffredinol canlynol yn helpu i leihau'r siawns o halogiad.Cael ystafelloedd dynodedig ar wahân, neu o leiaf ardaloedd ffisegol ar wahân, ar gyfer: paratoi mastermix, echdynnu asid niwclëig ac ychwanegu templed DNA, mwyhau a thrin cynnyrch chwyddedig, a dadansoddi cynnyrch, ee electrofforesis gel.

Mewn rhai lleoliadau, mae cael 4 ystafell ar wahân yn anodd.Opsiwn posibl ond llai dymunol yw paratoi'r mastermix mewn ardal gyfyngiant, ee cabinet llif laminaidd.Yn achos ymhelaethiad PCR nythu, dylid paratoi'r mastermix ar gyfer yr adwaith ail rownd yn yr ardal 'lân' ar gyfer paratoi mastermix, ond dylid gwneud y brechiad â'r cynnyrch PCR cynradd yn yr ystafell ymhelaethu, ac os yn bosibl mewn ardal gyfyngiant bwrpasol (ee cabinet llif laminaidd).

Mae angen set ar wahân o bibedau wedi'u labelu'n glir, blaenau ffilter, raciau tiwb, fortecsau, allgyrchyddion (os yw'n berthnasol), beiros, adweithyddion labordy generig, cotiau labordy a blychau o fenig wedi'u labelu'n glir, a fydd yn aros yn eu gweithfannau priodol ar gyfer pob ystafell/ardal.Rhaid golchi dwylo a newid menig a chotiau labordy wrth symud rhwng yr ardaloedd dynodedig.Ni ddylid symud adweithyddion ac offer o fan budr i fan glân.Pe bai achos eithafol yn codi lle mae angen symud adweithydd neu ddarn o offer am yn ôl, yn gyntaf rhaid ei ddadheintio â sodiwm hypoclorit 10%, ac yna ei sychu â dŵr di-haint.

Nodyn

Rhaid paratoi'r hydoddiant hypoclorit sodiwm 10% yn ffres bob dydd.Pan gaiff ei ddefnyddio ar gyfer dadheintio, dylid cadw at isafswm amser cyswllt o 10 munud.
Fel arall, gellir defnyddio cynhyrchion sydd ar gael yn fasnachol ac sydd wedi'u dilysu fel dadheintyddion arwyneb sy'n dinistrio DNA os nad yw argymhellion diogelwch lleol yn caniatáu defnyddio sodiwm hypoclorit neu os nad yw sodiwm hypoclorit yn addas ar gyfer dadheintio rhannau metelaidd offer.

Yn ddelfrydol, dylai staff gadw at yr ethos llif gwaith un cyfeiriad a pheidio â mynd o fannau budr (ar ôl PCR) yn ôl i ardaloedd glân (cyn-PCR) ar yr un diwrnod.Fodd bynnag, efallai y bydd adegau pan na ellir osgoi hyn.Pan fydd achlysur o'r fath yn codi, rhaid i bersonél fod yn ofalus i olchi dwylo'n drylwyr, newid menig, defnyddio'r gôt labordy ddynodedig a pheidio â chyflwyno unrhyw offer y byddant am ei dynnu allan o'r ystafell eto, fel llyfrau labordy.Dylid pwysleisio mesurau rheoli o'r fath mewn hyfforddiant staff ar ddulliau moleciwlaidd.

Ar ôl eu defnyddio, dylid glanhau mannau meinciau â 10% o sodiwm hypoclorit (wedi'i ddilyn gan ddŵr di-haint i gael gwared â channydd gweddilliol), 70% ethanol, neu ddadheintydd dinistrio DNA dilys sydd ar gael yn fasnachol.Yn ddelfrydol, dylid gosod lampau uwch-fioled (UV) i alluogi dadheintio trwy arbelydru.Fodd bynnag, dylid cyfyngu'r defnydd o lampau UV i fannau gweithio caeedig, ee cypyrddau diogelwch, er mwyn cyfyngu ar amlygiad UV y staff labordy.Cofiwch gadw at gyfarwyddiadau'r gwneuthurwr ar gyfer gofalu am lampau UV, awyru a glanhau er mwyn sicrhau bod lampau'n parhau i fod yn effeithiol.

Os ydych chi'n defnyddio 70% ethanol yn lle sodiwm hypoclorit, bydd angen arbelydru â golau UV i gwblhau'r dadheintio.
Peidiwch â glanhau'r fortecs a'r centrifuge â sodiwm hypochlorit;yn lle hynny, sychwch â 70% ethanol a dod i gysylltiad â golau UV, neu defnyddiwch ddadheintydd masnachol sy'n dinistrio DNA.Ar gyfer gollyngiadau, holwch y gwneuthurwr am gyngor glanhau pellach.Os yw cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr yn caniatáu hynny, dylai pibedau gael eu sterileiddio'n rheolaidd gan awtoclaf.Os na ellir awtoclafio pibedau, dylai fod yn ddigon i'w glanhau â 10% o sodiwm hypoclorit (wedi'i sychu'n drylwyr â dŵr di-haint) neu â diheintydd masnachol sy'n dinistrio DNA ac yna amlygiad UV.

Gall glanhau gyda chanran uchel o sodiwm hypoclorit niweidio plastigau a metelau pibed yn y pen draw os caiff ei wneud yn rheolaidd;gwirio argymhellion gan y gwneuthurwr yn gyntaf.Mae angen graddnodi'r holl offer yn rheolaidd yn unol â'r amserlen a argymhellir gan y gwneuthurwr.Dylai person dynodedig fod yn gyfrifol am sicrhau y cedwir at yr amserlen galibradu, y cedwir cofnodion manwl, a bod labeli gwasanaeth yn cael eu harddangos yn glir ar yr offer.

3. Cyngor ar ddefnyddio a glanhau ar gyfer y gofod moleciwlaidd dynodedig

Cyn-PCR: Dynodi adweithydd / paratoi mastermix: Dylai hwn fod y gofod glanaf a ddefnyddir ar gyfer paratoi arbrofion moleciwlaidd ac yn ddelfrydol dylai fod yn gabinet llif laminaidd dynodedig gyda golau UV.Rhaid peidio â thrin samplau, asid niwclëig wedi'i dynnu a chynhyrchion PCR chwyddedig yn y maes hwn.Dylid cadw adweithyddion ymhelaethu mewn rhewgell (neu oergell, yn unol ag argymhellion y gwneuthurwr) yn yr un gofod dynodedig, yn ddelfrydol wrth ymyl y cabinet llif laminaidd neu'r ardal cyn-PCR.Dylid newid menig bob tro wrth fynd i mewn i'r ardal cyn-PCR neu'r cabinet llif laminaidd.

Dylid glanhau'r ardal cyn-PCR neu'r cabinet llif laminaidd cyn ac ar ôl ei ddefnyddio fel a ganlyn: Sychwch bob eitem yn y cabinet, ee pibedau, blychau tip, fortecs, centrifuge, raciau tiwb, beiros, ac ati gyda 70% ethanol neu a dadhalogydd masnachol sy'n dinistrio DNA, a chaniatáu iddo sychu.Yn achos ardal waith gaeedig, ee cabinet llif laminaidd, dinoethwch y cwfl i olau UV am 30 munud.

Nodyn

Peidiwch ag amlygu adweithyddion i olau UV;dim ond pan fydd yn lân y dylech eu symud i'r cabinet.Os ydych chi'n perfformio PCR trawsgrifio o chwith, efallai y byddai'n ddefnyddiol hefyd sychu arwynebau ac offer gyda datrysiad sy'n torri i lawr RNAses ar gyswllt.Gall hyn helpu i osgoi canlyniadau ffug-negyddol o ddiraddiad ensym RNA.Ar ôl dadheintio a chyn paratoi'r mastermix, dylid newid menig unwaith eto, ac yna mae'r cabinet yn barod i'w ddefnyddio.

Cyn-PCR: Echdynnu asid niwcleig / ychwanegu templed:

Rhaid echdynnu asid niwclëig a'i drin mewn ail ardal ddynodedig, gan ddefnyddio set ar wahân o bibedau, awgrymiadau hidlo, raciau tiwb, menig ffres, cotiau labordy ac offer arall. Mae'r ardal hon hefyd ar gyfer ychwanegu templed, rheolaethau a llinellau tueddiadau i'r tiwbiau neu blatiau mastermix.Er mwyn osgoi halogi'r samplau asid niwclëig a echdynnwyd sy'n cael eu dadansoddi, argymhellir newid menig cyn trin rheolaethau neu safonau cadarnhaol a defnyddio set ar wahân o bibedau.Rhaid peidio â phibedu adweithyddion PCR a chynhyrchion chwyddedig yn y maes hwn.Dylid storio samplau mewn oergelloedd neu rewgelloedd dynodedig yn yr un ardal.Dylid glanhau'r man gwaith sampl yn yr un modd â'r gofod mastermix.

Ôl-PCR: Ymhelaethu a thrin y cynnyrch chwyddedig

Mae'r gofod dynodedig hwn ar gyfer prosesau ôl-ymhelaethu a dylai fod ar wahân yn ffisegol i'r ardaloedd cyn-PCR.Mae fel arfer yn cynnwys thermocwlwyr a llwyfannau amser real, ac yn ddelfrydol dylai fod â chabinet llif laminaidd ar gyfer ychwanegu'r cynnyrch PCR crwn 1 i'r adwaith rownd 2, os yw PCR nythu yn cael ei berfformio.Ni ddylid trin adweithyddion PCR ac asid niwclëig wedi'i dynnu yn yr ardal hon gan fod y risg o halogiad yn uchel.Dylai fod gan yr ardal hon set ar wahân o fenig, cotiau labordy, raciau plât a thiwb, pibedau, blaenau hidlo, biniau ac offer arall.Rhaid centrifugio tiwbiau cyn agor.Dylid glanhau'r man gwaith sampl yn yr un modd â'r gofod mastermix.

Ôl-PCR: Dadansoddi cynnyrch

Mae'r ystafell hon ar gyfer offer canfod cynnyrch, ee tanciau electrofforesis gel, pecynnau pŵer, trawsoleuydd UV a'r system dogfennu gel.Dylai fod gan yr ardal hon setiau ar wahân o fenig, cotiau labordy, raciau plât a thiwb, pibedau, blaenau hidlo, biniau ac offer arall.Ni ellir dod ag unrhyw adweithyddion eraill i'r ardal hon, ac eithrio llifyn llwytho, marciwr moleciwlaidd a gel agarose, a chydrannau byffer.Dylid glanhau'r man gwaith sampl yn yr un modd â'r gofod mastermix.

Nodyn pwysig

Yn ddelfrydol, ni ddylid mynd i mewn i'r ystafelloedd cyn PCR ar yr un diwrnod os oes gwaith eisoes wedi'i wneud yn yr ystafelloedd ôl-PCR.Os yw hyn yn gwbl anochel, sicrhewch fod dwylo'n cael eu golchi'n drylwyr yn gyntaf a bod cotiau labordy penodol yn cael eu gwisgo yn yr ystafelloedd.Ni ddylid mynd â llyfrau labordy a gwaith papur i'r ystafelloedd cyn PCR os ydynt wedi cael eu defnyddio yn yr ystafelloedd ôl-PCR;os oes angen, cymerwch allbrintiau dyblyg o brotocolau/IDau sampl, ac ati.

4. Cyngor cyffredinol ar fioleg foleciwlaidd

Defnyddiwch fenig di-powdr i osgoi ataliad assay.Mae techneg pibio gywir yn hollbwysig i leihau halogiad.Gall pibellau anghywir arwain at dasgu wrth ddosbarthu hylifau a chreu aerosolau.Mae arferion da ar gyfer pibio cywir i'w gweld yn y dolenni canlynol: Canllaw Gilson i bibio, fideos techneg pibellau Anachem, tiwbiau Allgyrchu cyn agor, a'u hagor yn ofalus i osgoi tasgu.Caewch y tiwbiau yn syth ar ôl eu defnyddio i osgoi cyflwyno halogion.

Wrth berfformio adweithiau lluosog, paratowch un mastermix sy'n cynnwys adweithyddion cyffredin (ee dŵr, dNTPs, byffer, paent preimio ac ensymau) i leihau nifer y trosglwyddiadau adweithyddion a lleihau'r bygythiad o halogiad.Argymhellir sefydlu'r mastermix ar rew neu floc oer.Gall defnyddio ensym Hot Start helpu i leihau cynhyrchiant cynhyrchion amhenodol.Diogelu adweithyddion sy'n cynnwys stilwyr fflwroleuol rhag golau er mwyn osgoi diraddio.

5. Rheolaethau mewnol

Cynhwyswch reolaethau cadarnhaol a negyddol sydd wedi'u nodweddu'n dda, wedi'u cadarnhau, ynghyd â rheolaeth dim templed ym mhob adwaith, a llinell duedd titrated aml-bwynt ar gyfer adweithiau meintiol.Ni ddylai'r rheolaeth gadarnhaol fod mor gryf fel ei fod yn peri risg o halogiad.Cynnwys rheolaethau echdynnu positif a negyddol wrth berfformio echdynnu asid niwclëig.

Argymhellir bod cyfarwyddiadau clir yn cael eu postio ym mhob un o'r meysydd fel bod defnyddwyr yn ymwybodol o reolau ymddygiad.Efallai y bydd labordai diagnostig sy'n canfod lefelau isel iawn o DNA neu RNA mewn samplau clinigol am fabwysiadu'r mesur diogelwch ychwanegol o gael systemau trin aer ar wahân gyda phwysedd aer ychydig yn bositif yn yr ystafelloedd cyn-PCR a phwysedd aer ychydig yn negyddol yn yr ystafelloedd ôl-PCR.

Yn olaf, mae datblygu cynllun sicrhau ansawdd (SA) yn ddefnyddiol.Dylai cynllun o'r fath gynnwys rhestrau o brif stociau a stociau gwaith adweithyddion, rheolau ar gyfer storio citiau ac adweithyddion, adrodd ar ganlyniadau rheoli, rhaglenni hyfforddi staff, algorithmau datrys problemau, a chamau adfer pan fo angen.

6. Llyfryddiaeth

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Pennod 3: Sefydlu labordy qPCR.Dogfen ganllaw ar gyfer profi dyfroedd hamdden gan ddefnyddio dull qPCR USEPA 1611. Lansing- Prifysgol Talaith Michigan.

Iechyd Cyhoeddus Lloegr, GIG.Safonau’r DU ar gyfer ymchwiliadau microbioleg: Arfer Labordy Da wrth gynnal profion chwyddo moleciwlaidd).Arweiniad Ansawdd.2013; 4(4):1–15.

Mifflin T. Sefydlu labordy PCR.Protoc Oer y Gwanwyn Harb.2007;7.

Schroeder S 2013. Cynnal a chadw arferol centrifuges: glanhau, cynnal a chadw a diheintio centrifuges, rotorau ac addaswyr (Papur gwyn Rhif 14).Hambwrg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Arfer Labordy Clinigol Da (GCLP) ar gyfer profion moleciwlaidd a ddefnyddir mewn labordai diagnostig, Yn: Akyar I, golygydd.Sbectra eang o reoli ansawdd.Rijeka, Croatia: Intech;2011: 29–52.