Molekulární detekční metody mají schopnost produkovat velký objem nukleové kyseliny prostřednictvím amplifikace stopových množství nalezených ve vzorcích.I když je to výhodné pro umožnění citlivé detekce, přináší to také možnost kontaminace prostřednictvím šíření amplifikačních aerosolů v laboratorním prostředí.Při provádění experimentů lze přijmout opatření, aby se zabránilo kontaminaci činidel, laboratorního vybavení a prostoru lavice, protože taková kontaminace může generovat falešně pozitivní (nebo falešně negativní) výsledky.

Aby se snížila pravděpodobnost kontaminace, měla by se vždy dodržovat správná laboratorní praxe.Konkrétně je třeba přijmout opatření týkající se následujících bodů:

1. Manipulace s činidly
2. Organizace pracovního prostoru a vybavení
3. Doporučení k použití a čištění pro určený molekulární prostor
4. Obecné rady molekulární biologie
5. Vnitřní kontroly
6. Bibliografie

1. Manipulace s činidly

Před otevřením zkumavky s reagenciemi krátce odstřeďte, aby se zabránilo tvorbě aerosolů.Alikvotní reagencie, aby se zabránilo vícenásobnému zmrazení-rozmrazení a kontaminaci kmenových zásob.Všechny zkumavky a reakční zkumavky jasně označte a označte datem a zaznamenejte čísla šarží a šarží použitých ve všech experimentech.Pomocí filtračních špiček napipetujte všechna činidla a vzorky.Před nákupem je vhodné ověřit si u výrobce, že špičky filtru odpovídají značce použité pipety.

2. Organizace pracovního prostoru a vybavení

Pracovní prostor by měl být organizován tak, aby tok práce probíhal jedním směrem, od čistých oblastí (před PCR) po špinavé oblasti (po PCR).Následující obecná opatření pomohou snížit možnost kontaminace.Mít oddělené určené místnosti nebo minimálně fyzicky oddělené prostory pro: přípravu mastermixu, extrakci nukleové kyseliny a přidání templátu DNA, amplifikaci a manipulaci s amplifikovaným produktem a analýzu produktu, např. gelovou elektroforézu.

V některých prostředích je obtížné mít 4 oddělené místnosti.Možnou, ale méně žádoucí možností je provést přípravu mastermixu v uzavřeném prostoru, např. ve skříni s laminárním prouděním.V případě nested PCR amplifikace by měla být příprava mastermixu pro druhé kolo reakce připravena v „čistém“ prostoru pro přípravu mastermixu, ale inokulace primárním PCR produktem by měla být provedena v amplifikační místnosti, a pokud je to možné ve vyhrazeném ochranném prostoru (např. skříň s laminárním prouděním).

Každá místnost/oblast potřebuje samostatnou sadu jasně označených pipet, filtračních špiček, stojanů na zkumavky, vortexů, odstředivek (pokud jsou relevantní), per, generických laboratorních činidel, laboratorních plášťů a krabic s rukavicemi, které zůstanou na příslušných pracovních stanicích.Při pohybu mezi určenými oblastmi je nutné si umýt ruce a vyměnit rukavice a laboratorní pláště.Činidla a vybavení by se nemělo přemisťovat ze znečištěného místa do čistého.Pokud by došlo k extrémnímu případu, kdy je třeba reagencie nebo zařízení posunout dozadu, je nutné je nejprve dekontaminovat 10% chlornanem sodným a poté otírat sterilní vodou.

Poznámka

10% roztok chlornanu sodného se musí připravovat denně čerstvý.Při použití k dekontaminaci by měla být dodržena minimální doba kontaktu 10 minut.
Alternativně lze použít komerčně dostupné produkty, které jsou validovány jako povrchové dekontaminanty ničící DNA, pokud místní bezpečnostní doporučení neumožňují použití chlornanu sodného nebo pokud chlornan sodný není vhodný pro dekontaminaci kovových částí zařízení.

V ideálním případě by zaměstnanci měli dodržovat étos jednosměrného pracovního toku a nepřecházet ze špinavých oblastí (po PCR) zpět do čistých oblastí (před PCR) ve stejný den.Mohou však nastat situace, kdy je to nevyhnutelné.Když taková příležitost nastane, personál se musí postarat o to, aby si důkladně umyl ruce, vyměnil si rukavice, použil k tomu určený laboratorní plášť a nevnášel žádné vybavení, které bude chtít znovu odnést z místnosti, jako jsou laboratorní knihy.Tato kontrolní opatření by měla být zdůrazněna při školení personálu o molekulárních metodách.

Po použití by měly být prostory lavice vyčištěny 10% chlornanem sodným (a následně sterilní vodou k odstranění zbytkového bělidla), 70% etanolem nebo ověřeným komerčně dostupným dekontaminantem ničícím DNA.V ideálním případě by měly být instalovány ultrafialové (UV) lampy, které umožňují dekontaminaci ozářením.Použití UV lamp by však mělo být omezeno na uzavřené pracovní prostory, např. bezpečnostní skříně, aby se omezilo vystavení pracovníků laboratoře UV záření.Dodržujte prosím pokyny výrobce pro péči o UV lampu, její větrání a čištění, abyste zajistili, že lampy zůstanou účinné.

Při použití 70% etanolu místo chlornanu sodného bude k dokončení dekontaminace potřeba ozáření UV světlem.
Nečistěte vír a odstřeďujte chlornanem sodným;místo toho otřete 70% etanolem a vystavte UV světlu nebo použijte komerční dekontaminační prostředek ničící DNA.V případě rozlití se obraťte na výrobce ohledně dalších rad ohledně čištění.Pokud to pokyny výrobce umožňují, měly by být pipety běžně sterilizovány v autoklávu.Pokud pipety nelze autoklávovat, mělo by stačit vyčistit je 10% chlornanem sodným (s následným důkladným otřením sterilní vodou) nebo komerčním dekontaminačním prostředkem ničícím DNA s následným vystavením UV záření.

Čištění vysokoprocentním chlornanem sodným může nakonec poškodit plasty a kovy pipet, pokud se provádí pravidelně;nejprve zkontrolujte doporučení od výrobce.Všechna zařízení je třeba pravidelně kalibrovat podle plánu doporučeného výrobcem.Určená osoba by měla být zodpovědná za to, že bude dodržován plán kalibrace, budou vedeny podrobné záznamy a na zařízení budou jasně umístěny servisní štítky.

3. Doporučení k použití a čištění pro určený molekulární prostor

Pre-PCR: Alikvotování činidel / příprava mastermixu: Toto by mělo být nejčistší ze všech prostor používaných pro přípravu molekulárních experimentů a v ideálním případě by to měla být určená skříň s laminárním prouděním vybavená UV světlem.V této oblasti se nesmí manipulovat se vzorky, extrahovanou nukleovou kyselinou a amplifikovanými produkty PCR.Amplifikační reagencie by měly být uchovávány v mrazáku (nebo lednici, podle doporučení výrobce) ve stejném určeném prostoru, ideálně vedle skříně s laminárním tokem nebo oblasti před PCR.Rukavice by se měly měnit pokaždé, když vstoupíte do oblasti před PCR nebo do komory s laminárním prouděním.

Oblast pre-PCR nebo skříň s laminárním prouděním by se měly před a po použití vyčistit následujícím způsobem: Otřete všechny předměty ve skříni, např. pipety, krabičky na špičky, vortex, centrifugu, stojany na zkumavky, pera atd. 70% etanolem nebo komerční dekontaminační prostředek na ničení DNA a nechte uschnout.V případě uzavřeného pracovního prostoru, např. skříně s laminárním prouděním, vystavte digestoř UV záření po dobu 30 minut.

Poznámka

Nevystavujte činidla UV záření;přesuňte je do skříně až poté, co je čistá.Při provádění reverzní transkripční PCR může být také užitečné otřít povrchy a vybavení roztokem, který rozkládá RNázy při kontaktu.To může pomoci vyhnout se falešně negativním výsledkům enzymové degradace RNA.Po dekontaminaci a před přípravou mastermixu je třeba rukavice ještě jednou vyměnit a poté je skříň připravena k použití.

Pre-PCR: Extrakce nukleové kyseliny/přidání šablony:

Nukleová kyselina se musí extrahovat a manipulovat s ní v druhé určené oblasti pomocí samostatné sady pipet, filtračních špiček, stojanů na zkumavky, čerstvých rukavic, laboratorních plášťů a dalšího vybavení. Tato oblast je také pro přidání šablony, kontrol a trendových linií do zkumavky nebo desky s mastermixem.Aby se zabránilo kontaminaci vzorků extrahovaných nukleových kyselin, které jsou analyzovány, doporučuje se před manipulací s pozitivními kontrolami nebo standardy vyměnit rukavice a použít samostatnou sadu pipet.Reagencie PCR a amplifikované produkty se do této oblasti nesmí pipetovat.Vzorky by měly být skladovány v určených chladničkách nebo mrazničkách ve stejném prostoru.Pracovní prostor vzorku by měl být vyčištěn stejným způsobem jako prostor mastermixu.

Post-PCR: Amplifikace a manipulace s amplifikovaným produktem

Tento vyhrazený prostor je pro postamplifikační procesy a měl by být fyzicky oddělen od oblastí před PCR.Obvykle obsahuje termocyklery a platformy v reálném čase a v ideálním případě by měl mít skříň s laminárním tokem pro přidání produktu PCR 1. kola do reakce 2. kola, pokud se provádí vnořená PCR.V této oblasti se nesmí manipulovat s reagenciemi PCR a extrahovanou nukleovou kyselinou, protože riziko kontaminace je vysoké.Tato oblast by měla mít samostatnou sadu rukavic, laboratorních plášťů, stojanů na talíře a zkumavky, pipet, filtračních špiček, zásobníků a dalšího vybavení.Zkumavky musí být před otevřením odstředěny.Pracovní prostor vzorku by měl být vyčištěn stejným způsobem jako prostor mastermixu.

Post-PCR: Analýza produktu

Tato místnost je určena pro zařízení pro detekci produktů, např. nádrže pro gelovou elektroforézu, napájecí zdroje, UV transiluminátor a systém dokumentace gelu.Tato oblast by měla mít samostatné sady rukavic, laboratorní pláště, stojany na talíře a zkumavky, pipety, špičky filtrů, zásobníky a další vybavení.Do této oblasti nelze vnášet žádná další činidla, s výjimkou nanášecího barviva, molekulárního markeru a agarózového gelu a složek pufru.Pracovní prostor vzorku by měl být vyčištěn stejným způsobem jako prostor mastermixu.

Důležitá poznámka

V ideálním případě by se do místností před PCR nemělo vstupovat ve stejný den, pokud se v místnostech po PCR již pracovalo.Pokud je to zcela nevyhnutelné, zajistěte si nejprve důkladně umýt ruce a v místnostech nosit specifické laboratorní pláště.Laboratorní knihy a papíry se nesmí brát do místností před PCR, pokud byly použity v místnostech po PCR;v případě potřeby pořiďte duplicitní výtisky protokolů/ID vzorků atd.

4. Obecné rady molekulární biologie

Používejte rukavice bez pudru, abyste zabránili inhibici testu.Správná technika pipetování je rozhodující pro snížení kontaminace.Nesprávné pipetování může mít za následek rozstřikování při dávkování kapalin a vytváření aerosolů.Osvědčené postupy pro správné pipetování naleznete na následujících odkazech: Gilsonův průvodce pipetováním, videa o technice pipetování Anachem, Před otevřením zkumavky odstřeďte a opatrně je otevřete, aby nedošlo k rozstříknutí.Ihned po použití zkumavky uzavřete, aby se zabránilo vnesení kontaminantů.

Při provádění více reakcí připravte jeden mastermix obsahující běžná činidla (např. vodu, dNTP, pufr, primery a enzym), abyste minimalizovali počet přenosů činidel a snížili hrozbu kontaminace.Doporučuje se postavit mastermix na led nebo studený blok.Použití enzymu Hot Start může pomoci snížit produkci nespecifických produktů.Reagencie obsahující fluorescenční sondy chraňte před světlem, aby se zabránilo degradaci.

5. Vnitřní kontroly

Zahrňte dobře charakterizované, potvrzené pozitivní a negativní kontroly, spolu s kontrolou bez šablony ve všech reakcích a vícebodovou titrovanou trendovou linii pro kvantitativní reakce.Pozitivní kontrola by neměla být tak silná, aby představovala riziko kontaminace.Při provádění extrakce nukleové kyseliny zahrňte pozitivní a negativní kontroly extrakce.

Doporučuje se, aby byly v každé z oblastí umístěny jasné pokyny, aby si uživatelé byli vědomi pravidel chování.Diagnostické laboratoře, které detekují velmi nízké hladiny DNA nebo RNA v klinických vzorcích, mohou chtít přijmout další bezpečnostní opatření spočívající v tom, že budou mít samostatné vzduchotechnické systémy s mírně pozitivním tlakem vzduchu v místnostech před PCR a mírně negativním tlakem vzduchu v místnostech po PCR.

Konečně je užitečné vypracovat plán zajištění kvality (QA).Takový plán by měl obsahovat seznamy hlavních zásob reagencií a pracovních zásob, pravidla pro skladování souprav a reagencií, podávání zpráv o výsledcích kontrol, programy školení personálu, algoritmy odstraňování problémů a nápravná opatření v případě potřeby.

6. Bibliografie

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapitola 3: Nastavení laboratoře qPCR.Dokument s pokyny pro testování rekreačních vod pomocí metody USEPA qPCR 1611. Lansing-Michigan State University.

Public Health England, NHS.Britské standardy pro mikrobiologická vyšetření: Správná laboratorní praxe při provádění molekulárních amplifikačních testů).Kvalitní vedení.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Zřízení laboratoře PCR.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Běžná údržba centrifug: čištění, údržba a dezinfekce centrifug, rotorů a adaptérů (Bílá kniha č. 14).Hamburk: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Správná klinická laboratorní praxe (GCLP) pro molekulární testy používané v diagnostických laboratořích, In: Akyar I, editor.Široké spektrum kontroly kvality.Rijeka, Chorvatsko: Intech;2011: 29.–52.