I metudi di rilevazione moleculare anu a capacità di pruduce un grande volume di l'acidu nucleicu attraversu l'amplificazione di quantità traccia truvate in campioni.Mentre chì questu hè benefica per attivà a rilevazione sensitiva, introduce ancu a pussibilità di contaminazione per via di a diffusione di aerosol di amplificazione in l'ambiente di laboratoriu.Quandu si facenu esperimenti, e misure ponu esse intraprese per evità a contaminazione di i reagenti, l'equipaggiu di laboratoriu è u spaziu di u bancu, postu chì a contaminazione pò generà risultati falsi pusitivi (o falsi negativi).

Per aiutà à riduce a probabilità di contaminazione, a Good Laboratory Practice deve esse esercitata in ogni mumentu.In particulare, si deve piglià precauzioni riguardu à i seguenti punti:

1. Manipulazione di reagenti
2. Urganizazione di u spaziu di travagliu è l'equipaggiu
3. Aduprà è cunsiglii di pulizia per u spaziu molecular designatu
4. Cunsigliu generale di biologia moleculare
5. Cuntrolli interni
6. Bibliografia

1. Manipulazione di reagenti

Centrifuga brevemente i tubi di reagenti prima di apre per evità a generazione di aerosol.Reagenti aliquote per evità parechji congelamenti-discongeli è a contaminazione di i stock maestri.Chjaramente etichettate è date tutti i tubi di reagenti è di reazione è mantenenu logs di lotte di reagenti è numeri di batch utilizati in tutti l'esperimenti.Pipettate tutti i reagenti è i campioni cù punte di filtru.Prima di cumprà, hè cunsigliu di cunfirmà cù u fabricatore chì i punte di i filtri sò adattati à a marca di pipette per esse usata.

2. Urganizazione di u spaziu di travagliu è l'equipaggiu

U spaziu di travagliu deve esse urganizatu per assicurà chì u flussu di u travagliu si faci in una direzzione, da i spazii puliti (pre-PCR) à i zoni brutti (post-PCR).E seguenti precautions generale aiutanu à riduce a probabilità di contaminazione.Avè stanze designate separate, o almenu spazii fisici separati, per: preparazione di mastermix, estrazione di l'acidu nucleicu è aghjunta di mudelli di DNA, amplificazione è manipulazione di u produttu amplificatu, è analisi di u produttu, per esempiu, elettroforesi di gel.

In certi paràmetri, avè 4 stanze separate hè difficiule.Una opzione pussibule, ma menu desiderata, hè di fà a preparazione di mastermix in una zona di cuntinimentu, per esempiu, un cabinet di flussu laminare.In u casu di l'amplificazione di PCR nidificata, a preparazione di u mastermix per a reazione di a seconda volta deve esse preparatu in l'area "pulita" per a preparazione di mastermix, ma l'inoculazione cù u pruduttu PCR primariu deve esse fatta in a sala di amplificazione, è se pussibule. in una zona di cuntinimentu dedicata (per esempiu, un cabinet di flussu laminare).

Ogni stanza/zona hà bisognu di un set separatu di pipette chjaramente marcate, punte di filtri, rack di tubi, vortici, centrifughe (se pertinente), penne, reagenti di laboratori generici, camice di laboratori è scatuli di guanti chì resteranu in i so rispettivi posti di travagliu.E mani deve esse lavate è i guanti è i camice di laboratoriu cambiatu quandu si move trà e zone designate.I reagenti è l'equipaggiu ùn deve esse spustatu da una zona brutta à una zona pulita.In casu di un casu estremu induve un reattivu o un equipamentu deve esse spustatu in daretu, deve prima esse decontaminatu cù 10% di ipoclorito di sodiu, seguitu da una pulita cù acqua sterile.

Nota

A suluzione di ipoclorito di sodiu 10% deve esse preparata fresca ogni ghjornu.Quandu s'utilice per a decontaminazione, deve esse rispettatu un tempu minimu di cuntattu di 10 minuti.
In alternativa, i prudutti commerciali chì sò validati cum'è decontaminanti di superficia chì distruggenu l'ADN ponu esse aduprati se i cunsiglii di sicurezza lucali ùn permettenu micca l'usu di l'ipoclorito di sodiu o se l'ipoclorito di sodiu ùn hè micca adattatu per a decontaminazione di e parti metalliche di l'equipaggiu.

Ideale, u persunale deve esse rispettatu da l'etica di u flussu di travagliu unidirezionale è ùn andate micca da e zone brutte (post-PCR) à e zone pulite (pre-PCR) u stessu ghjornu.Tuttavia, ci ponu esse occasioni quandu questu hè inevitabbile.Quandu si presenta una tale occasione, u persunale deve esse attentu à lavà bè e mani, cambià i guanti, aduprate u mantellu di laboratoriu designatu è ùn intruduce micca l'equipaggiu chì vulianu caccià di novu da a stanza, cum'è i libri di laboratoriu.Tali misure di cuntrollu deve esse enfatizatu in a furmazione di u persunale nantu à i metudi molecolari.

Dopu l'usu, i spazii di u bancu deve esse puliti cù 10% ipoclorito di sodiu (seguitu da l'acqua sterile per caccià u bleach residuale), 70% etanol, o un decontaminante chì distrugge l'ADN cunvalidatu cummerciale.Ideale, lampade ultraviolette (UV) deve esse stallate per attivà a decontaminazione per irradiazione.Tuttavia, l'usu di lampade UV deve esse limitatu à i spazii di travagliu chjusi, per esempiu, armari di sicurezza, per limità l'esposizione UV di u staffu di u laboratoriu.Per piacè rispettate l'istruzzioni di u fabricatore per a cura, a ventilazione è a pulizia di lampade UV per assicurà chì e lampade restanu efficaci.

Se si usa 70% etanol invece di l'ipoclorito di sodiu, l'irradiazione cù u lume UV serà necessariu per cumpletà a decontaminazione.
Ùn pulite micca u vortice è centrifuga cù ipoclorito di sodiu;invece, sguassate cù 70% etanol è espose à a luce UV, o aduprà un decontaminant DNA-distruzzione cummerciale.Per spills, verificate cù u fabricatore per più cunsiglii di pulizia.Se l'istruzzioni di u fabricatore permettenu, e pipette devenu esse sterilizzate in rutina in autoclave.Se e pipette ùn ponu micca esse autoclavate, deve esse abbastanza per pulisce cù l'ipoclorito di sodiu 10% (seguitu da una pulitura curretta cù acqua sterile) o cù un decontaminante cummerciale chì distrugge l'ADN seguitu da l'esposizione UV.

A pulitura cù l'ipoclorito di sodiu d'altu percentualità pò eventualmente dannà i plastichi di pipette è metalli s'ellu hè fattu nantu à una basa regulare;verificate prima i cunsiglii da u fabricatore.Tuttu l'equipaggiu deve esse calibratu regularmente secondu u calendariu cunsigliatu da u fabricatore.Una persona designata deve esse incaricata di assicurà chì u calendariu di calibrazione hè rispettatu, i logs detallati sò mantenuti, è l'etichette di serviziu sò chjaramente affissate nantu à l'equipaggiu.

3. Aduprà è cunsiglii di pulizia per u spaziu molecular designatu

Pre-PCR: Preparazione di aliquotazione di reagenti / mastermix: Questu deve esse u più pulitu di tutti i spazi utilizati per a preparazione di esperimenti moleculari è deve esse idealmente un armadiu di flussu laminare designatu equipatu di una luce UV.I campioni, l'acidu nucleicu estratti è i prudutti di PCR amplificati ùn devenu esse trattati in questa zona.I reagenti di l'amplificazione deve esse guardati in un congelatore (o frigorifero, secondu i cunsiglii di u fabricatore) in u stessu spaziu designatu, idealmente vicinu à l'armadiu di flussu laminare o l'area pre-PCR.I guanti deve esse cambiatu ogni volta à l'ingressu à l'area pre-PCR o l'armadiu di flussu laminare.

L'area di pre-PCR o l'armadiu di flussu laminare deve esse pulita prima è dopu l'usu cum'è seguita: Asciugà tutti l'articuli in l'armadiu, per esempiu pipette, scatole di punta, vortex, centrifuga, rack di tubi, penne, ecc. cù 70% etanolu o decontaminant cumerciu DNA-distruzzione, è permette à asciucà.In u casu di un spaziu di travagliu chjusu, per esempiu, un armariu di flussu laminare, espone a cappa à a luce UV per 30 minuti.

Nota

Ùn espone micca i reagenti à a luce UV;mova solu in l'armadiu una volta chì hè pulita.Sè eseguisce a PCR di trascrizione inversa, pò ancu esse utile per asciugà e superfici è l'equipaggiu cù una suluzione chì rompe RNases à u cuntattu.Questu pò aiutà à evità risultati falsi negativi da a degradazione enzimatica di l'RNA.Dopu a decontaminazione è prima di preparà u mastermix, i guanti deve esse cambiatu una volta di più, è dopu l'armadiu hè prestu à aduprà.

Pre-PCR: estrazione di acidi nucleici/aggiunta di mudelli:

L'acidu nucleicu deve esse estratti è trattatu in una seconda zona designata, utilizendu un set separatu di pipette, punte di filtri, rack di tubi, guanti freschi, camice di labburatoriu è altre equipaggiu. tubi o piastre mastermix.Per evità a contaminazione di i campioni di l'acidu nucleicu estratti chì sò stati analizzati, hè cunsigliatu di cambià i guanti prima di manipulà cuntrolli o standardi pusitivi è di utilizà un set separatu di pipette.I reagenti PCR è i prudutti amplificati ùn devenu micca pipettati in questa zona.I campioni devenu esse guardati in frigoriferi o congelatori designati in a stessa zona.U spaziu di travagliu di mostra deve esse puliti in listessa manera chì u spaziu mastermix.

Post-PCR: Amplificazione è manipulazione di u pruduttu amplificatu

Stu spaziu designatu hè per i prucessi post-amplificazione è deve esse fisicamente separatu da e zone pre-PCR.Di solitu cuntene termociclatori è piattaforme in tempu reale, è idealmente deve avè un gabinettu di flussu laminare per aghjunghje u produttu PCR round 1 à a reazione round 2, se a PCR nidificata hè stata realizata.I reagenti di PCR è l'acidu nucleicu estratti ùn deve micca esse trattatu in questa zona postu chì u risicu di contaminazione hè altu.Questa zona duverebbe avè un set separatu di guanti, camice di labburatoriu, racks di piatti è tubi, pipette, punte di filtri, bidoni è altri equipaggiamenti.I tubi devenu esse centrifugati prima di apre.U spaziu di travagliu di mostra deve esse puliti in listessa manera chì u spaziu mastermix.

Post-PCR: Analisi di u produttu

Questa stanza hè per l'equipaggiu di rilevazione di u produttu, per esempiu, tanki di elettroforesi di gel, pacchetti di energia, transilluminatore UV è u sistema di documentazione di gel.Questa zona duverebbe avè insemi separati di guanti, camice di labburatoriu, rack di piatti è tubi, pipette, punte di filtri, bidoni è altre equipaggiu.Nisun altru reattivu pò esse purtatu in questa zona, escludendu u colorante di carica, u marcatore moleculare è u gel di agarose, è i cumpunenti di buffer.U spaziu di travagliu di mostra deve esse puliti in listessa manera chì u spaziu mastermix.

Nota impurtante

Ideale, e stanze pre-PCR ùn deve micca esse inserite in u stessu ghjornu se u travagliu hè digià statu realizatu in e camere post-PCR.Se questu hè cumplettamente inevitabbile, assicuratevi chì e mani sò prima lavate bè è chì i cappotti di laboratoriu specifichi sò purtati in e stanze.I libri di labburatoriu è i documenti ùn devenu esse purtati in e stanze pre-PCR si sò stati aduprati in e stanze post-PCR;se necessariu, pigliate stampe duplicate di protokolli / ID di mostra, etc.

4. Cunsigliu generale di biologia moleculare

Aduprate guanti senza polvere per evità l'inibizione di l'analisi.A tecnica di pipetting curretta hè di primura per riduce a contaminazione.Un pipettamentu sbagliatu pò causà spruzzi durante l'erogazione di liquidi è a creazione di aerosol.Una bona pratica per u pipettamentu currettu pò esse truvata à i seguenti ligami: Gilson guide to pipetting, Anachem pipetting technique videos, Centrifuge tubes before opening, and open them carefully to avoid splashing.Chiudere i tubi immediatamente dopu l'usu per evità l'intruduzioni di contaminanti.

Quandu eseguite parechje reazioni, preparate un mastermix chì cuntene reagenti cumuni (per esempiu, acqua, dNTPs, buffer, primers è enzima) per minimizzà u numeru di trasferimenti di reagenti è riduce a minaccia di contaminazione.Hè ricumandemu di stallà u mastermix nantu à u ghjacciu o un bloccu friddu.L'usu di una enzima Hot Start pò aiutà à riduce a produzzione di prudutti micca specifichi.Prutegge i reagenti chì cuntenenu sonde fluorescenti da a luce per evità a degradazione.

5. Cuntrolli interni

Includite cuntrolli pusitivi è negativi cunfirmati bè carattarizati, cù un cuntrollu senza mudellu in tutte e reazzione, è una linea di tendenza titrata multipuntu per reazzione quantitativa.U cuntrollu pusitivu ùn deve esse cusì forte chì pone un risicu di contaminazione.Includite cuntrolli di estrazione pusitivi è negativi quandu eseguite l'estrazione di l'acidu nucleicu.

Hè ricumandemu chì l'istruzzioni chjari sò publicati in ogni zona per chì l'utilizatori sò cunuscenti di e regule di cumportamentu.I laboratori di diagnostichi chì rilevanu livelli assai bassi di DNA o RNA in i campioni clinichi puderanu aduttà a misura di sicurezza supplementaria di avè sistemi di gestione di l'aria separati cù una pressione d'aria ligeramente positiva in e camere pre-PCR è una pressione d'aria ligeramente negativa in e camere post-PCR.

Infine, sviluppà un pianu di assicuranza di qualità (QA) hè utile.Un tali pianu duveria include liste di stock maestri di reagenti è stock di travagliu, regule per l'almacenamiento di kit è reagenti, rapportu di risultati di cuntrollu, prugrammi di furmazione di u persunale, algoritmi di risoluzione di prublemi, è azioni di rimediu quandu hè necessariu.

6. Bibliografia

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