Ang mga pamaagi sa pag-detect sa molekula adunay katakus nga makahimo og daghang gidaghanon sa nucleic acid pinaagi sa pagpadako sa mga gidaghanon sa pagsubay nga makita sa mga sample.Samtang kini mapuslanon alang sa pagpagana sa sensitibo nga pagkakita, gipaila usab niini ang posibilidad sa kontaminasyon pinaagi sa pagkaylap sa mga amplification aerosol sa palibot sa laboratoryo.Kung nagpahigayon mga eksperimento, mahimo’g himuon ang mga lakang aron malikayan ang kontaminasyon sa mga reagents, kagamitan sa laboratoryo ug bench space, tungod kay ang ingon nga kontaminasyon mahimo’g makamugna og bakak nga positibo (o bakak nga negatibo) nga mga sangputanan.

Aron makatabang sa pagpakunhod sa posibilidad sa kontaminasyon, ang Maayong Laboratory Practice kinahanglan nga gamiton sa tanang panahon.Sa espesipiko, ang mga pag-amping kinahanglan buhaton bahin sa mga musunud nga punto:

1. Pagdumala sa mga reagents
2. Organisasyon sa workspace ug ekipo
3. Paggamit ug tambag sa paglimpiyo alang sa gitudlo nga luna sa molekula
4. Kinatibuk-ang molecular biology nga tambag
5. Internal nga mga kontrol
6. Bibliograpiya

1. Pagdumala sa mga reagents

I-centrifuge ang mga tubo sa reagent sa dili pa ablihan aron malikayan ang pagmugna og mga aerosol.Aliquot reagents aron malikayan ang daghang freeze-thaws ug ang kontaminasyon sa master stocks.Klaro nga label ug petsahan ang tanang reagent ug reaction tubes ug ipadayon ang mga troso sa reagent lot ug batch number nga gigamit sa tanang eksperimento.Pipette ang tanang reagents ug sample gamit ang mga tip sa filter.Sa dili pa mopalit, maayo nga kumpirmahon sa tiggama nga ang mga tip sa filter mohaum sa brand sa pipette nga gamiton.

2. Organisasyon sa workspace ug ekipo

Ang workspace kinahanglang organisado aron maseguro nga ang dagan sa trabaho mahitabo sa usa ka direksyon, gikan sa limpyo nga mga lugar (pre-PCR) ngadto sa hugaw nga mga lugar (post-PCR).Ang mosunod nga kinatibuk-ang pag-amping makatabang sa pagpakunhod sa kahigayonan sa kontaminasyon.Pagbaton ug linain nga gitakdang mga lawak, o sa labing gamay nga pisikal nga bulag nga mga lugar, para sa: mastermix nga pagpangandam, nucleic acid extraction ug DNA template nga pagdugang, pagpadako ug pagdumala sa gipadako nga produkto, ug pagtuki sa produkto, eg gel electrophoresis.

Sa pipila ka mga setting, lisud ang pagbaton ug 4 nga separado nga kwarto.Usa ka posible apan dili kaayo gusto nga kapilian mao ang paghimo sa mastermix nga pag-andam sa usa ka sulud nga lugar, pananglitan usa ka laminar flow cabinet.Sa kaso sa nested PCR amplification, ang pag-andam sa mastermix alang sa ikaduhang hugna nga reaksyon kinahanglan nga andamon sa 'limpyo' nga lugar alang sa pag-andam sa mastermix, apan ang inoculation nga adunay nag-unang produkto sa PCR kinahanglan nga buhaton sa amplification room, ug kung mahimo. sa usa ka gipahinungod nga sulud nga lugar (eg usa ka laminar flow cabinet).

Ang matag lawak/lugar nagkinahanglan ug bulag nga set sa tin-aw nga gimarkahan nga mga pipette, filter tips, tube racks, vortex, centrifuges (kon may kalabutan), pen, generic lab reagents, lab coat ug mga kahon sa gwantes nga magpabilin sa ilang tagsa-tagsa ka workstation.Kinahanglang hugasan ang mga kamot ug ilisan ang mga gwantis ug mga lab coat kung maglihok taliwala sa gitudlo nga mga lugar.Ang mga reagents ug kagamitan kinahanglan dili ibalhin gikan sa usa ka hugaw nga lugar ngadto sa usa ka limpyo nga lugar.Kung adunay usa ka grabe nga kaso diin ang usa ka reagent o piraso sa kagamitan kinahanglan nga ibalhin pabalik, kinahanglan una nga ma-decontaminate kini sa 10% sodium hypochlorite, sundan sa pagpahid sa sterile nga tubig.

Nota

Ang 10% nga solusyon sa sodium hypochlorite kinahanglan nga lab-as kada adlaw.Kung gigamit alang sa pag-decontamination, kinahanglan nga sundon ang labing gamay nga oras sa pagkontak nga 10 minuto.
Sa laing bahin, ang mga produkto nga magamit sa komersyo nga gi-validate ingon nga mga decontaminant sa nawong nga makadaot sa DNA mahimong magamit kung ang mga rekomendasyon sa lokal nga kaluwasan dili motugot sa paggamit sa sodium hypochlorite o kung ang sodium hypochlorite dili angay alang sa pag-decontaminate sa metal nga mga bahin sa kagamitan.

Sa tinuud, ang mga kawani kinahanglan nga mosunod sa unidirectional work flow ethos ug dili moadto gikan sa hugaw nga mga lugar (post-PCR) balik ngadto sa limpyo nga mga lugar (pre-PCR) sa samang adlaw.Bisan pa, adunay mga higayon nga kini dili malikayan.Kung mahitabo ang ingon nga okasyon, ang mga kawani kinahanglan nga mag-amping sa paghugas sa mga kamot, pag-ilis sa mga gwantis, paggamit sa gitudlo nga lab coat ug dili magpaila sa bisan unsang kagamitan nga gusto nilang kuhaon pag-usab sa kwarto, sama sa mga libro sa lab.Ang ingon nga mga lakang sa pagkontrol kinahanglan nga hatagan og gibug-aton sa pagbansay sa mga kawani sa mga pamaagi sa molekula.

Human sa paggamit, ang mga lingkoranan kinahanglan nga limpyohan sa 10% sodium hypochlorite (gisundan sa sterile nga tubig aron makuha ang nahabilin nga bleach), 70% nga ethanol, o usa ka balido nga komersyal nga magamit nga DNA-destroying decontaminant.Sa maayo nga paagi, ang ultra-violet (UV) nga mga lampara kinahanglan nga ibutang aron makahimo sa pag-decontamination pinaagi sa irradiation.Bisan pa, ang paggamit sa mga lampara sa UV kinahanglan nga limitado sa mga sirado nga lugar nga nagtrabaho, pananglitan sa mga kabinet sa kaluwasan, aron malimitahan ang pagkaladlad sa UV sa kawani sa laboratoryo.Palihug tumana ang mga instruksyon sa tiggama alang sa pag-atiman sa UV lamp, bentilasyon ug paglimpyo aron masiguro nga ang mga lampara magpabilin nga epektibo.

Kung mogamit ug 70% nga ethanol imbes nga sodium hypochlorite, kinahanglan ang pag-irradiation gamit ang UV nga kahayag aron makompleto ang decontamination.
Ayaw paglimpyo sa vortex ug centrifuge sa sodium hypochlorite;sa baylo, pagpahid sa 70% nga ethanol ug iladlad sa UV nga kahayag, o paggamit sa usa ka komersyal nga DNA-paglaglag decontaminant.Alang sa mga spills, susiha ang tiggama alang sa dugang nga tambag sa paglimpyo.Kung gitugotan kini sa mga panudlo sa tiggama, ang mga pipette kinahanglan nga kanunay nga isterilisado pinaagi sa autoclave.Kung dili ma-autoclave ang mga pipette, igo na nga limpyohan kini gamit ang 10% sodium hypochlorite (gisundan og maayo nga pagpahid sa sterile nga tubig) o uban ang komersyal nga DNA-destroying decontaminant nga gisundan sa UV exposure.

Ang paglimpyo gamit ang taas nga porsyento nga sodium hypochlorite mahimong makadaot sa pipette nga mga plastik ug metal kung buhaton kanunay;susiha una ang mga rekomendasyon gikan sa tiggama.Ang tanan nga kagamitan kinahanglan nga ma-calibrate kanunay sumala sa girekomenda nga iskedyul sa tiggama.Ang usa ka gitudlo nga tawo kinahanglan nga responsable sa pagsiguro nga ang iskedyul sa pagkakalibrate gisunod, ang mga detalyado nga troso gipadayon, ug ang mga label sa serbisyo tin-aw nga gipakita sa mga kagamitan.

3. Paggamit ug tambag sa paglimpiyo alang sa gitudlo nga luna sa molekula

Pre-PCR: Pag-andam sa reagent aliquoting / mastermix: Kini kinahanglan nga labing limpyo sa tanan nga mga luna nga gigamit alang sa pag-andam sa mga eksperimento sa molekula ug kinahanglan nga usa ka gitudlo nga laminar flow cabinet nga adunay suga nga UV.Ang mga sample, gikuha nga nucleic acid ug gipadako nga mga produkto sa PCR kinahanglan dili dumalahon sa kini nga lugar.Ang mga amplification reagents kinahanglang ibutang sa freezer (o refrigerator, sumala sa mga rekomendasyon sa tiggama) sa samang gitakdang luna, labing maayo nga tapad sa laminar flow cabinet o pre-PCR area.Ang mga gwantis kinahanglan nga usbon matag higayon nga mosulod sa pre-PCR area o laminar flow cabinet.

Ang pre-PCR area o laminar flow cabinet kinahanglang limpyohan sa dili pa ug human sa paggamit sama sa mosunod: Pahiran ang tanang butang sa cabinet, eg pipettes, tip boxes, vortex, centrifuge, tube racks, pens, ug uban pa gamit ang 70% ethanol o a komersyal nga DNA-paglaglag decontaminant, ug tugoti nga mamala.Sa kaso sa usa ka sirado nga working area, eg usa ka laminar flow cabinet, ibutyag ang hood sa UV nga kahayag sulod sa 30 minutos.

Nota

Ayaw ibutyag ang mga reagents sa UV nga kahayag;ibalhin lang sila sa kabinet kung limpyo na.Kung maghimo ug reverse transcription PCR, mahimo usab nga makatabang ang pagpahid sa mga ibabaw ug kagamitan gamit ang solusyon nga makaguba sa mga RNases sa kontak.Makatabang kini aron malikayan ang sayup nga negatibo nga mga sangputanan gikan sa pagkadaot sa enzyme sa RNA.Human sa decontamination ug sa dili pa mag-andam sa mastermix, ang mga gwantis kinahanglan nga usbon pag-usab, ug dayon ang kabinet andam na nga gamiton.

Pre-PCR: Pagkuha sa nucleic acid/pagdugang sa template:

Ang nucleic acid kinahanglan nga makuha ug dumalahon sa usa ka ikaduha nga gitudlo nga lugar, gamit ang usa ka bulag nga set sa mga pipette, mga tip sa filter, mga rack sa tubo, presko nga gwantis, mga coat sa lab ug uban pang kagamitan. Kini nga lugar alang usab sa pagdugang sa template, mga kontrol ug mga trendline sa mastermix nga mga tubo o mga plato.Aron malikayan ang kontaminasyon sa gikuha nga nucleic acid nga mga sampol nga gi-analisa, girekomendar nga mag-ilis og gwantes sa dili pa magdumala sa mga positibong kontrol o mga sumbanan ug mogamit og bulag nga set sa mga pipette.Ang mga PCR reagents ug amplified nga mga produkto kinahanglan dili ipa-pipet sa kini nga lugar.Ang mga sample kinahanglan nga tipigan sa gitudlo nga mga fridge o freezer sa parehas nga lugar.Ang sample nga workspace kinahanglan nga limpyohan sa parehas nga paagi sa mastermix space.

Post-PCR: Pagpadako ug pagdumala sa gipadako nga produkto

Kining gitudlo nga luna kay para sa post-amplification nga mga proseso ug kinahanglang pisikal nga bulag sa pre-PCR areas.Kasagaran kini adunay mga thermocyclers ug real-time nga mga plataporma, ug mas maayo nga adunay laminar flow cabinet alang sa pagdugang sa round 1 PCR nga produkto sa round 2 nga reaksyon, kung ang nested PCR gihimo.Ang mga PCR reagents ug gikuha nga nucleic acid kinahanglan dili atimanon sa kini nga lugar tungod kay ang peligro sa kontaminasyon taas.Kini nga lugar kinahanglan adunay usa ka lahi nga hugpong sa mga gwantis, mga lab coat, mga rack sa plato ug tubo, mga pipette, mga tip sa pagsala, mga bin ug uban pang kagamitan.Ang mga tubo kinahanglan nga ma-centrifuge sa dili pa ablihan.Ang sample nga workspace kinahanglan nga limpyohan sa parehas nga paagi sa mastermix space.

Post-PCR: Pagtuki sa produkto

Kini nga kwarto alang sa mga kagamitan sa pagtuki sa produkto, pananglitan mga tangke sa gel electrophoresis, mga power pack, UV transilluminator ug ang sistema sa dokumentasyon sa gel.Kini nga lugar kinahanglan adunay bulag nga set sa mga gwantis, lab coat, plate ug tube racks, pipettes, filter tips, bins ug uban pang kagamitan.Walay laing mga reagents ang madala niini nga lugar, walay labot sa loading dye, molecular marker ug agarose gel, ug buffer components.Ang sample nga workspace kinahanglan nga limpyohan sa parehas nga paagi sa mastermix space.

Importante nga nota

Labing maayo, ang mga lawak sa pre-PCR kinahanglan dili pasudlon sa samang adlaw kung ang trabaho nahimo na sa mga post-PCR nga mga lawak.Kung kini dili gyud malikayan, siguroha nga ang mga kamot hugasan una ug maayo ug nga ang piho nga mga lab coat gisul-ob sa mga kwarto.Ang mga lab books ug mga papeles kinahanglang dili dad-on sa pre-PCR rooms kung kini gigamit sa post-PCR rooms;kung gikinahanglan, pagkuha og mga duplicate nga print-out sa mga protocol/sample ID, ug uban pa.

4. Kinatibuk-ang molecular biology nga tambag

Gamit ug powder-free gloves para malikayan ang assay inhibition.Ang husto nga pamaagi sa pipetting hinungdanon aron makunhuran ang kontaminasyon.Ang dili husto nga pagpipet mahimong moresulta sa pagsabwag sa pag-apod-apod sa mga likido ug paghimo sa mga aerosol.Ang maayong praktis para sa saktong pipetting makita sa mosunod nga mga link: Gilson guide to pipetting, Anachem pipetting technique videos, Centrifuge tubes sa dili pa ablihan, ug ablihi kini pag-ayo aron malikayan ang pagsabwag.Isira dayon ang mga tubo human magamit aron malikayan ang pagpasulod sa mga kontaminante.

Kung maghimo ug daghang reaksyon, pag-andam ug usa ka mastermix nga adunay sagad nga mga reagents (pananglitan sa tubig, dNTPs, buffer, primers ug enzyme) aron mamenosan ang gidaghanon sa pagbalhin sa reagent ug makunhuran ang hulga sa kontaminasyon.Girekomenda nga ibutang ang mastermix sa yelo o usa ka bugnaw nga bloke.Ang paggamit sa usa ka Hot Start enzyme mahimong makatabang sa pagpakunhod sa produksyon sa dili piho nga mga produkto.Panalipdi ang mga reagents nga adunay fluorescent probes gikan sa kahayag aron malikayan ang pagkadaot.

5. Internal nga mga kontrol

Ilakip ang maayo nga pagkahulagway, gikumpirma nga positibo ug negatibo nga mga kontrol, kauban ang usa ka walay-template nga kontrol sa tanan nga mga reaksyon, ug usa ka multi-point titrated trendline alang sa quantitative nga mga reaksyon.Ang positibo nga pagkontrol kinahanglan dili kusog kaayo nga kini adunay peligro sa kontaminasyon.Ilakip ang positibo ug negatibo nga mga kontrol sa pagkuha kung maghimo sa pagkuha sa nucleic acid.

Girekomenda nga ang tin-aw nga mga panudlo ibutang sa matag usa sa mga lugar aron ang mga tiggamit makahibalo sa mga lagda sa pamatasan.Ang mga diagnostic lab nga nakamatikod sa ubos kaayo nga lebel sa DNA o RNA sa mga klinikal nga sample mahimong gusto nga mosagop sa dugang nga sukod sa seguridad nga adunay bulag nga sistema sa pagdumala sa hangin nga adunay gamay nga positibo nga presyur sa hangin sa pre-PCR nga mga lawak ug gamay nga negatibo nga presyur sa hangin sa post-PCR nga mga lawak.

Katapusan, ang pagpalambo sa usa ka plano sa kalidad nga kasiguruhan (QA) makatabang.Ang ingon nga plano kinahanglan nga maglakip sa mga lista sa mga reagent master stocks ug nagtrabaho nga mga stock, mga lagda sa pagtipig sa mga kit ug reagents, pagreport sa mga resulta sa pagkontrol, mga programa sa pagbansay sa mga kawani, mga algorithm sa pag-troubleshoot, ug mga remedial nga aksyon kung gikinahanglan.

6. Bibliograpiya

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapitulo 3: Pag-set up sa qPCR laboratory.Usa ka dokumento sa giya alang sa pagsulay sa mga tubig sa kalingawan gamit ang pamaagi sa USEPA qPCR 1611. Lansing- Michigan State University.

Public Health England, NHS.Mga sumbanan sa UK alang sa mga imbestigasyon sa microbiology: Maayong Pagpraktis sa Laboratory kung nagpahigayon mga pagsulay sa pagpadako sa molekula).Kalidad nga Giya.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Pagbutang ug PCR laboratory.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Ang kanunay nga pagmentinar sa mga centrifuges: paglimpyo, pagmentinar ug pagdisinfection sa mga centrifuges, rotors ug adapters (White paper No. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Maayo nga Clinical Laboratory Practice (GCLP) alang sa mga pagsulay nga nakabase sa molekula nga gigamit sa mga laboratoryo sa diagnostic, Sa: Akyar I, editor.Lapad nga spectra sa pagkontrol sa kalidad.Rijeka, Croatia: Intech;2011: 29–52.