Els mètodes de detecció molecular tenen la capacitat de produir un gran volum d'àcid nucleic mitjançant l'amplificació de quantitats traces trobades a les mostres.Tot i que això és beneficiós per permetre la detecció sensible, també introdueix la possibilitat de contaminació mitjançant la propagació d'aerosols d'amplificació a l'entorn del laboratori.Quan es realitzen experiments, es poden prendre mesures per evitar la contaminació de reactius, equips de laboratori i espai de banc, ja que aquesta contaminació pot generar resultats falsos positius (o falsos negatius).

Per ajudar a reduir la probabilitat de contaminació, s'han d'exercir en tot moment les bones pràctiques de laboratori.Concretament, s'han de prendre precaucions sobre els punts següents:

1. Manipulació de reactius
2. Organització de l'espai de treball i dels equipaments
3. Consells d'ús i neteja de l'espai molecular designat
4. Assessorament general de biologia molecular
5. Controls interns
6. Bibliografia

1. Manipulació de reactius

Centrifugueu breument els tubs de reactius abans d'obrir-los per evitar la generació d'aerosols.Reactius al·lícuotes per evitar múltiples congelacions-descongelacions i la contaminació de les existències mestres.Etiqueteu i dateu clarament tots els tubs de reactius i de reacció i mantingueu els registres dels números de lot i lot de reactius utilitzats en tots els experiments.Pipeteu tots els reactius i mostres amb puntes de filtre.Abans de comprar, és recomanable confirmar amb el fabricant que les puntes del filtre s'ajusten a la marca de pipeta que s'ha d'utilitzar.

2. Organització de l'espai de treball i dels equipaments

L'espai de treball s'ha d'organitzar per garantir que el flux de treball es produeix en una direcció, des de les zones netes (pre-PCR) fins a les zones brutes (post-PCR).Les següents precaucions generals ajudaran a reduir la possibilitat de contaminació.Tenir sales designades separades, o com a mínim àrees separades físicament, per a: preparació de mescles mestra, extracció d'àcids nucleics i addició de plantilles d'ADN, amplificació i manipulació del producte amplificat i anàlisi de productes, per exemple, electroforesi en gel.

En alguns entorns, tenir 4 habitacions separades és difícil.Una opció possible però menys desitjable és fer la preparació de la mescla mestra en una àrea de contenció, per exemple, un armari de flux laminar.En el cas de l'amplificació de PCR imbricada, la preparació de la mescla mestra per a la reacció de la segona ronda s'ha de preparar a l'àrea "neta" per a la preparació de la mescla mestra, però la inoculació amb el producte de PCR primari s'ha de fer a la sala d'amplificació, i si és possible en una àrea de contenció dedicada (per exemple, un armari de flux laminar).

Cada habitació/àrea necessita un conjunt separat de pipetes clarament etiquetades, puntes de filtre, bastidors de tubs, vòrtexs, centrífugues (si escau), bolígrafs, reactius genèrics de laboratori, bates de laboratori i caixes de guants que romandran a les seves respectives estacions de treball.S'han de rentar les mans i canviar-se els guants i les bates de laboratori quan es mouen entre les zones designades.Els reactius i l'equip no s'han de moure d'una zona bruta a una zona neta.En cas que es produeixi un cas extrem en què un reactiu o un equip s'hagi de moure cap enrere, primer s'ha de descontaminar amb hipoclorit de sodi al 10%, seguit d'una neteja amb aigua estèril.

Nota

La solució d'hipoclorit de sodi al 10% s'ha de preparar diàriament.Quan s'utilitza per a la descontaminació, s'ha de respectar un temps de contacte mínim de 10 minuts.
Alternativament, es poden utilitzar productes comercials validats com a descontaminants superficials que destrueixen l'ADN si les recomanacions de seguretat locals no permeten l'ús d'hipoclorit de sodi o si l'hipoclorit de sodi no és adequat per descontaminar les parts metàl·liques dels equips.

Idealment, el personal hauria de respectar l'ètica del flux de treball unidireccional i no passar de les zones brutes (post-PCR) a les zones netes (pre-PCR) el mateix dia.Tanmateix, hi pot haver ocasions en què això sigui inevitable.Quan es presenti aquesta ocasió, el personal ha de tenir cura de rentar-se bé les mans, canviar-se els guants, utilitzar la bata de laboratori designada i no introduir cap equip que vulgui treure de la sala, com ara llibres de laboratori.Aquestes mesures de control s'han de posar èmfasi en la formació del personal sobre mètodes moleculars.

Després de l'ús, els espais del banc s'han de netejar amb hipoclorit de sodi al 10% (seguit d'aigua estèril per eliminar el lleixiu residual), etanol al 70% o un descontaminant destructor d'ADN comercialment validat.Idealment, s'han d'instal·lar làmpades ultravioletes (UV) per permetre la descontaminació per irradiació.No obstant això, l'ús de làmpades UV s'hauria de restringir a zones de treball tancades, com ara armaris de seguretat, per tal de limitar l'exposició UV del personal del laboratori.Si us plau, seguiu les instruccions del fabricant per a la cura, la ventilació i la neteja de les làmpades UV per garantir que les làmpades segueixin sent efectives.

Si s'utilitza etanol al 70% en comptes d'hipoclorit de sodi, caldrà irradiar amb llum UV per completar la descontaminació.
No netegeu el vòrtex i centrifugueu amb hipoclorit de sodi;en comptes d'això, netegeu amb etanol al 70% i exposeu-lo a la llum UV o utilitzeu un descontaminant comercial que destrueix l'ADN.En cas de vessaments, consulteu amb el fabricant per obtenir més consells de neteja.Si les instruccions del fabricant ho permeten, les pipetes s'han d'esterilitzar habitualment amb autoclau.Si les pipetes no es poden autoclau, n'hi ha prou amb netejar-les amb hipoclorit de sodi al 10% (seguit d'una neteja a fons amb aigua estèril) o amb un descontaminant comercial que destrueix l'ADN i exposició als raigs UV.

La neteja amb un alt percentatge d'hipoclorit de sodi pot danyar els plàstics i els metalls de les pipetes si es fa de manera regular;primer comproveu les recomanacions del fabricant.Tots els equips s'han de calibrar regularment segons el calendari recomanat pel fabricant.Una persona designada hauria de ser l'encarregada d'assegurar-se que es compleixi el calendari de calibratge, que es mantinguin registres detallats i que les etiquetes de servei es mostrin clarament a l'equip.

3. Consells d'ús i neteja de l'espai molecular designat

Pre-PCR: alícuota de reactius / preparació de mescles mestres: aquest hauria de ser el més net de tots els espais utilitzats per a la preparació d'experiments moleculars i, idealment, hauria de ser un armari de flux laminar designat equipat amb llum UV.Les mostres, l'àcid nucleic extret i els productes de PCR amplificats no s'han de manipular en aquesta zona.Els reactius d'amplificació s'han de conservar en un congelador (o refrigerador, segons les recomanacions del fabricant) al mateix espai designat, idealment al costat de l'armari de flux laminar o l'àrea de pre-PCR.Els guants s'han de canviar cada vegada en entrar a l'àrea de pre-PCR o a l'armari de flux laminar.

L'àrea de pre-PCR o l'armari de flux laminar s'ha de netejar abans i després de l'ús de la següent manera: Netegeu tots els elements de l'armari, com ara pipetes, caixes de puntes, vòrtex, centrífuga, bastidors de tubs, bolígrafs, etc. amb etanol al 70% o un descontaminant comercial que destrueix l'ADN i deixar assecar.En el cas d'una àrea de treball tancada, per exemple, un armari de flux laminar, exposar la campana a la llum UV durant 30 minuts.

Nota

No exposar els reactius a la llum UV;només introduïu-los a l'armari quan estigui net.Si es realitza PCR de transcripció inversa, també pot ser útil netejar les superfícies i l'equip amb una solució que descomponga les RNases en contacte.Això pot ajudar a evitar resultats falsos negatius de la degradació enzimàtica de l'ARN.Després de la descontaminació i abans de preparar la mastermix, els guants s'han de canviar una vegada més i, a continuació, l'armari està llest per utilitzar.

Pre-PCR: extracció d'àcids nucleics/addició de plantilla:

L'àcid nucleic s'ha d'extreure i manipular en una segona àrea designada, utilitzant un conjunt separat de pipetes, puntes de filtre, bastidors de tubs, guants frescos, bates de laboratori i altres equips. Aquesta àrea també serveix per afegir plantilles, controls i línies de tendència al tubs o plaques mastermix.Per evitar la contaminació de les mostres d'àcid nucleic extretes que s'estan analitzant, es recomana canviar els guants abans de manipular controls positius o estàndards i utilitzar un joc separat de pipetes.Els reactius de PCR i els productes amplificats no s'han de pipetejar en aquesta zona.Les mostres s'han d'emmagatzemar en neveres o congeladors designats a la mateixa zona.L'espai de treball de mostra s'ha de netejar de la mateixa manera que l'espai mastermix.

Post-PCR: Amplificació i manipulació del producte amplificat

Aquest espai designat és per a processos posteriors a l'amplificació i hauria d'estar físicament separat de les àrees pre-PCR.Normalment conté termocicladors i plataformes en temps real, i idealment hauria de tenir un gabinet de flux laminar per afegir el producte de PCR de la ronda 1 a la reacció de la ronda 2, si s'està realitzant una PCR imbricada.Els reactius de PCR i l'àcid nucleic extret no s'han de manipular en aquesta zona ja que el risc de contaminació és elevat.Aquesta àrea hauria de tenir un conjunt separat de guants, bates de laboratori, bastidors de plats i tubs, pipetes, puntes de filtre, contenidors i altres equips.Els tubs s'han de centrifugar abans d'obrir-los.L'espai de treball de mostra s'ha de netejar de la mateixa manera que l'espai mastermix.

Post-PCR: Anàlisi de producte

Aquesta sala és per a equips de detecció de productes, per exemple, tancs d'electroforesi en gel, paquets d'alimentació, transil·luminador UV i el sistema de documentació de gel.Aquesta zona hauria de tenir jocs separats de guants, bates de laboratori, bastidors de plats i tubs, pipetes, puntes de filtre, contenidors i altres equips.No es poden introduir altres reactius en aquesta àrea, excepte el colorant de càrrega, el marcador molecular i el gel d'agarosa i els components del tampó.L'espai de treball de mostra s'ha de netejar de la mateixa manera que l'espai mastermix.

Nota important

L'ideal és que les sales pre-PCR no s'hagin d'entrar el mateix dia si ja s'ha treballat a les sales post-PCR.Si això és completament inevitable, assegureu-vos que primer es renten bé les mans i que es portin bates de laboratori específiques a les habitacions.Els llibres de laboratori i la documentació no s'han de portar a les sales de pre-PCR si s'han utilitzat a les sales de post-PCR;si cal, feu impressions duplicades de protocols/ID de mostres, etc.

4. Assessorament general de biologia molecular

Utilitzeu guants sense pols per evitar la inhibició de l'assaig.La tècnica de pipeteig correcta és primordial per reduir la contaminació.Un pipeteig incorrecte pot provocar esquitxades en dispensar líquids i la creació d'aerosols.Les bones pràctiques per a un pipet correcte es poden trobar als enllaços següents: Guia Gilson per a pipetejar, Vídeos de la tècnica de pipeteig Anachem, Tubs de centrífuga abans d'obrir-los i obriu-los amb cura per evitar esquitxades.Tanqueu els tubs immediatament després de l'ús per evitar la introducció de contaminants.

Quan realitzeu múltiples reaccions, prepareu una mescla mestra que contingui reactius comuns (per exemple, aigua, dNTP, tampó, primers i enzim) per minimitzar el nombre de transferències de reactius i reduir l'amenaça de contaminació.Es recomana instal·lar la mastermix sobre gel o un bloc fred.L'ús d'un enzim Hot Start pot ajudar a reduir la producció de productes no específics.Protegiu de la llum els reactius que contenen sondes fluorescents per evitar la degradació.

5. Controls interns

Inclou controls positius i negatius ben caracteritzats i confirmats, juntament amb un control sense plantilla en totes les reaccions i una línia de tendència valorada en diversos punts per a les reaccions quantitatives.El control positiu no ha de ser tan fort que suposi un risc de contaminació.Incloeu controls d'extracció positius i negatius quan realitzeu l'extracció d'àcids nucleics.

Es recomana publicar instruccions clares a cadascuna de les zones perquè els usuaris coneguin les normes de conducta.Els laboratoris de diagnòstic que detecten nivells molt baixos d'ADN o ARN en mostres clíniques poden voler adoptar la mesura de seguretat addicional de tenir sistemes de manipulació d'aire separats amb una pressió d'aire lleugerament positiva a les sales de pre-PCR i una pressió d'aire lleugerament negativa a les sales de post-PCR.

Finalment, és útil desenvolupar un pla d'assegurament de la qualitat (QA).Aquest pla hauria d'incloure llistes d'existències mestres de reactius i estocs de treball, regles per emmagatzemar kits i reactius, informes de resultats de control, programes de formació del personal, algorismes de resolució de problemes i accions correctores quan sigui necessari.

6. Bibliografia

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Capítol 3: Configuració d'un laboratori de qPCR.Un document d'orientació per provar les aigües recreatives mitjançant el mètode qPCR de l'EPA 1611. Lansing- Michigan State University.

Salut Pública d'Anglaterra, NHS.Estàndards del Regne Unit per a investigacions de microbiologia: bones pràctiques de laboratori quan es realitzen assajos d'amplificació molecular).Orientació de qualitat.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Configuració d'un laboratori de PCR.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Manteniment rutinari de centrífugues: neteja, manteniment i desinfecció de centrífugues, rotors i adaptadors (Llibre blanc núm. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) per a proves de base molecular utilitzades en laboratoris de diagnòstic, a: Akyar I, editor.Ampli espectre de control de qualitat.Rijeka, Croàcia: Intech;2011: 29–52.