Metode molekularne detekcije imaju sposobnost da proizvedu veliku količinu nukleinske kiseline kroz amplifikaciju količina u tragovima pronađenih u uzorcima.Iako je ovo korisno za omogućavanje osjetljive detekcije, također uvodi mogućnost kontaminacije kroz širenje aerosola za pojačavanje u laboratorijskom okruženju.Prilikom izvođenja eksperimenata mogu se poduzeti mjere da se izbjegne kontaminacija reagensa, laboratorijske opreme i prostora na klupi, jer takva kontaminacija može dovesti do lažno pozitivnih (ili lažno negativnih) rezultata.

Kako bi se smanjila vjerovatnoća kontaminacije, treba stalno primjenjivati ​​dobru laboratorijsku praksu.Konkretno, potrebno je poduzeti mjere opreza u vezi sa sljedećim točkama:

1. Rukovanje reagensima
2. Organizacija radnog prostora i opreme
3. Savjeti za korištenje i čišćenje za određeni molekularni prostor
4. Opći savjeti iz molekularne biologije
5. Interne kontrole
6. Bibliografija

1. Rukovanje reagensima

Kratko centrifugirajte epruvete s reagensom prije otvaranja kako biste izbjegli stvaranje aerosola.Alikvotni reagensi za izbjegavanje višestrukog zamrzavanja-odmrzavanja i kontaminacije matičnih zaliha.Jasno označite i datirajte sve epruvete sa reagensima i reakcijskim epruvetama i vodite evidenciju serija reagensa i brojeva serija korištenih u svim eksperimentima.Odpipetirajte sve reagense i uzorke koristeći vrhove filtera.Prije kupovine, preporučljivo je kod proizvođača potvrditi da vrhovi filtera odgovaraju marki pipete koja se koristi.

2. Organizacija radnog prostora i opreme

Radni prostor treba organizirati tako da se osigura da se tok posla odvija u jednom smjeru, od čistih područja (pre-PCR) do prljavih područja (post-PCR).Sljedeće opće mjere opreza pomoći će da se smanji mogućnost kontaminacije.Imajte odvojene određene prostorije, ili najmanje fizički odvojene prostore, za: pripremu mastermiksa, ekstrakciju nukleinske kiseline i dodavanje DNK šablona, ​​amplifikaciju i rukovanje amplificiranim proizvodom i analizu proizvoda, npr. gel elektroforeza.

U nekim okruženjima je teško imati 4 odvojene sobe.Moguća, ali manje poželjna opcija je priprema mastermiksa u zatvorenom prostoru, npr. u kabinetu za laminarni protok.U slučaju ugniježđene PCR amplifikacije, pripremu mastermiksa za drugu rundu reakcije treba pripremiti u 'čistom' prostoru za pripremu mastermixa, ali inokulaciju primarnim PCR proizvodom treba obaviti u prostoriji za amplifikacija, i ako je moguće u posebnom prostoru za zadržavanje (npr. kabinet za laminarni protok).

Svaka prostorija/prostor treba poseban set jasno označenih pipeta, vrhova filtera, nosača za cijevi, vrtloga, centrifuga (ako je relevantno), olovke, generičke laboratorijske reagense, laboratorijske mantile i kutije za rukavice koje će ostati na njihovim radnim stanicama.Ruke se moraju oprati, a rukavice i laboratorijski mantili mijenjati kada se krećete između određenih područja.Reagense i opremu ne treba premještati iz prljavog u čist prostor.Ako dođe do ekstremnog slučaja u kojem se reagens ili dio opreme treba pomaknuti unatrag, prvo se mora dekontaminirati s 10% natrijum hipohlorita, nakon čega slijedi brisanje sterilnom vodom.

Bilješka

10% rastvor natrijum hipohlorita se mora svakodnevno pripremati svežom.Kada se koristi za dekontaminaciju, potrebno je pridržavati se minimalnog vremena kontakta od 10 minuta.
Alternativno, komercijalno dostupni proizvodi koji su potvrđeni kao površinski dekontaminanti koji uništavaju DNK mogu se koristiti ako lokalne sigurnosne preporuke ne dozvoljavaju upotrebu natrijevog hipoklorita ili ako natrijev hipoklorit nije prikladan za dekontaminaciju metalnih dijelova opreme.

U idealnom slučaju, osoblje treba da se pridržava etosa jednosmjernog toka rada i da se ne vraća iz prljavih područja (post-PCR) nazad u čista područja (pre-PCR) istog dana.Međutim, mogu postojati situacije kada je to neizbježno.Kada se ukaže takva prilika, osoblje mora voditi računa o tome da temeljito opere ruke, promijeni rukavice, koristi za to predviđeni laboratorijski mantil i ne unosi nikakvu opremu koju će htjeti ponovo iznijeti iz prostorije, kao što su laboratorijske knjige.Takve mjere kontrole treba naglasiti u obuci osoblja o molekularnim metodama.

Nakon upotrebe, prostore na klupama treba očistiti sa 10% natrijum hipohlorita (a zatim sterilnom vodom za uklanjanje ostataka izbeljivača), 70% etanolom ili validiranim komercijalno dostupnim dekontaminantom koji uništava DNK.U idealnom slučaju, treba postaviti ultraljubičaste (UV) lampe kako bi se omogućila dekontaminacija zračenjem.Međutim, korištenje UV lampi treba ograničiti na zatvorene radne prostore, npr. sigurnosne ormare, kako bi se ograničila izloženost laboratorijskog osoblja UV zračenju.Molimo pridržavajte se uputstava proizvođača za njegu UV lampe, ventilaciju i čišćenje kako biste osigurali da lampe ostanu efikasne.

Ako koristite 70% etanol umjesto natrijum hipohlorita, biće potrebno zračenje UV svjetlom da bi se završila dekontaminacija.
Nemojte čistiti vrtlog i centrifugirati natrijum hipohloritom;umjesto toga, obrišite sa 70% etanola i izložite UV svjetlu ili koristite komercijalni dekontaminant koji uništava DNK.U slučaju prosipanja, obratite se proizvođaču za daljnje savjete o čišćenju.Ako uputstva proizvođača to dozvoljavaju, pipete treba rutinski sterilisati u autoklavu.Ako se pipete ne mogu autoklavirati, trebalo bi ih očistiti sa 10% natrijum hipohlorita (posle toga temeljito prebrisati sterilnom vodom) ili komercijalnim dekontaminantom koji uništava DNK, nakon čega slijedi izlaganje UV zrakama.

Čišćenje natrijum hipohloritom visokog procenta može eventualno oštetiti plastiku i metale pipeta ako se obavlja redovno;prvo provjerite preporuke proizvođača.Sva oprema se mora redovno kalibrirati prema rasporedu koji preporučuje proizvođač.Određena osoba treba da bude zadužena da se pridržava rasporeda kalibracije, da se održavaju detaljni dnevnici i da su servisne naljepnice jasno prikazane na opremi.

3. Savjeti za korištenje i čišćenje za određeni molekularni prostor

Pre-PCR: Alikvotiranje reagensa/priprema mastermiksa: Ovo bi trebao biti najčistiji od svih prostora koji se koriste za pripremu molekularnih eksperimenata i idealno bi trebao biti određen kabinet za laminarni protok opremljen UV svjetlom.Uzorci, ekstrahirana nukleinska kiselina i amplificirani PCR proizvodi se ne smiju rukovati u ovom području.Reagense za pojačavanje treba čuvati u zamrzivaču (ili frižideru, prema preporukama proizvođača) u istom određenom prostoru, idealno pored kabineta za laminarni protok ili pre-PCR područja.Rukavice treba mijenjati svaki put pri ulasku u pre-PCR područje ili kabinet za laminarni protok.

Pre-PCR područje ili kabinet za laminarni protok treba očistiti prije i nakon upotrebe na sljedeći način: Obrišite sve predmete u ormariću, npr. pipete, kutije s vrhovima, vortex, centrifuge, police za cijevi, olovke, itd. sa 70% etanolom ili komercijalni dekontaminant koji uništava DNK i ostavite da se osuši.U slučaju zatvorenog radnog prostora, npr. ormara s laminarnim protokom, izložite napu UV svjetlu na 30 minuta.

Bilješka

Ne izlažite reagense UV zračenju;premjestite ih u ormar tek kada je čist.Ako se izvodi PCR reverzne transkripcije, također može biti od pomoći da obrišete površine i opremu otopinom koja razgrađuje RNaze pri kontaktu.Ovo može pomoći da se izbjegnu lažno negativni rezultati enzimske degradacije RNK.Nakon dekontaminacije i prije pripreme mastermiksa, rukavice treba još jednom promijeniti i tada je ormarić spreman za upotrebu.

Pre-PCR: ekstrakcija nukleinske kiseline/dodavanje šablona:

Nukleinska kiselina se mora ekstrahirati i rukovati njome u drugom određenom području, koristeći poseban set pipeta, vrhova filtera, nosača za cijevi, svježih rukavica, laboratorijskih mantila i druge opreme. Ovo područje je također za dodavanje šablona, ​​kontrola i linija trenda u mastermix cijevi ili ploče.Kako bi se izbjegla kontaminacija ekstrahiranih uzoraka nukleinske kiseline koji se analiziraju, preporučuje se zamjena rukavica prije rukovanja pozitivnim kontrolama ili standardima i korištenje odvojenog kompleta pipeta.PCR reagensi i pojačani proizvodi ne smiju se pipetirati u ovom području.Uzorke treba čuvati u određenim frižiderima ili zamrzivačima u istom prostoru.Radni prostor uzorka treba očistiti na isti način kao i prostor za mastermiks.

Post-PCR: Amplifikacija i rukovanje amplificiranim proizvodom

Ovaj određeni prostor je za postamplifikacijske procese i trebao bi biti fizički odvojen od pre-PCR područja.Obično sadrži termociklere i platforme u realnom vremenu, a idealno bi trebalo da ima kabinet laminarnog toka za dodavanje Round 1 PCR proizvoda u reakciju kruga 2, ako se izvodi ugniježđeni PCR.PCR reagensi i ekstrahirana nukleinska kiselina se ne smiju rukovati u ovom području jer je rizik od kontaminacije visok.Ovo područje treba imati poseban set rukavica, laboratorijskih mantila, nosača za ploče i epruvete, pipeta, vrhova filtera, kante i druge opreme.Epruvete se moraju centrifugirati prije otvaranja.Radni prostor uzorka treba očistiti na isti način kao i prostor za mastermiks.

Post-PCR: Analiza proizvoda

Ova prostorija je za opremu za detekciju proizvoda, npr. rezervoare za gel elektroforezu, agregate za napajanje, UV transiluminator i sistem za dokumentaciju gela.Ovo područje treba da ima odvojene komplete rukavica, laboratorijskih mantila, nosača za ploče i epruvete, pipete, vrhove filtera, kante i drugu opremu.Drugi reagensi se ne mogu unositi u ovo područje, osim boje za punjenje, molekularnog markera i agaroznog gela i komponenti pufera.Radni prostor uzorka treba očistiti na isti način kao i prostor za mastermiks.

Važna napomena

U idealnom slučaju, u prostorije pre PCR ne bi trebalo ulaziti istog dana ako je posao već obavljen u prostorijama za post-PCR.Ako je to potpuno neizbježno, pobrinite se da se ruke prvo dobro operu i da se u sobama nose posebni laboratorijski mantili.Laboratorijske knjige i papiri ne smiju se unositi u prostorije prije PCR-a ako su korišteni u prostorijama za post-PCR;ako je potrebno, uzmite duple ispise protokola/ID uzoraka, itd.

4. Opći savjeti iz molekularne biologije

Koristite rukavice bez pudera kako biste izbjegli inhibiciju analize.Ispravna tehnika pipetiranja je ključna za smanjenje kontaminacije.Neispravno pipetiranje može dovesti do prskanja pri ispuštanju tekućine i stvaranja aerosola.Dobra praksa za ispravno pipetiranje može se naći na sljedećim linkovima: Gilsonov vodič za pipetiranje, video zapisi o Anachem tehnici pipetiranja, epruvete za centrifugiranje prije otvaranja i pažljivo ih otvarajte kako biste izbjegli prskanje.Zatvorite epruvete odmah nakon upotrebe kako biste izbjegli unošenje kontaminanata.

Kada izvodite više reakcija, pripremite jednu glavnu mješavinu koja sadrži uobičajene reagense (npr. vodu, dNTP, pufer, prajmere i enzim) kako biste smanjili broj prijenosa reagensa i smanjili opasnost od kontaminacije.Preporučljivo je postaviti mastermix na led ili hladan blok.Upotreba enzima Hot Start može pomoći u smanjenju proizvodnje nespecifičnih proizvoda.Zaštitite reagense koji sadrže fluorescentne sonde od svjetlosti kako biste izbjegli degradaciju.

5. Interne kontrole

Uključiti dobro okarakterizirane, potvrđene pozitivne i negativne kontrole, zajedno s kontrolom bez šablona u svim reakcijama i titriranom linijom trenda u više tačaka za kvantitativne reakcije.Pozitivna kontrola ne bi trebala biti toliko jaka da predstavlja rizik od kontaminacije.Uključite pozitivne i negativne kontrole ekstrakcije kada izvodite ekstrakciju nukleinske kiseline.

Preporučuje se da se u svakoj oblasti postave jasne upute kako bi korisnici bili upoznati s pravilima ponašanja.Dijagnostičke laboratorije koje detektuju veoma niske nivoe DNK ili RNK u kliničkim uzorcima možda će želeti da usvoje dodatnu bezbednosnu meru da imaju odvojene sisteme za rukovanje vazduhom sa blago pozitivnim vazdušnim pritiskom u pre-PCR prostorijama i blago negativnim vazdušnim pritiskom u prostorijama posle PCR.

Na kraju, razvoj plana osiguranja kvaliteta (QA) je od pomoći.Takav plan bi trebao uključivati ​​liste glavnih zaliha reagensa i radnih zaliha, pravila za pohranjivanje kompleta i reagensa, izvješćivanje o rezultatima kontrole, programe obuke osoblja, algoritme za rješavanje problema i popravne radnje kada su potrebne.

6. Bibliografija

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Poglavlje 3: Uspostavljanje qPCR laboratorije.Vodič za testiranje rekreacijskih voda korištenjem USEPA qPCR metode 1611. Lansing-Michigan State University.

Javno zdravstvo Engleske, NHS.Britanski standardi za mikrobiološka istraživanja: Dobra laboratorijska praksa pri izvođenju testova molekularne amplifikacije).Vodič za kvalitet.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Uspostavljanje PCR laboratorije.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Rutinsko održavanje centrifuga: čišćenje, održavanje i dezinfekcija centrifuga, rotora i adaptera (Bijeli papir br. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Dobra klinička laboratorijska praksa (GCLP) za molekularne testove koji se koriste u dijagnostičkim laboratorijama, U: Akyar I, urednik.Široki spektar kontrole kvaliteta.Rijeka, Hrvatska: Intech;2011: 29–52.