Методите за молекулярно откриване имат способността да произвеждат голям обем нуклеинова киселина чрез усилване на следи от количества, открити в пробите.Въпреки че това е полезно за позволяване на чувствително откриване, то също така въвежда възможността за замърсяване чрез разпространение на аерозоли за усилване в лабораторната среда.При провеждане на експерименти могат да се предприемат мерки за избягване на замърсяване на реактиви, лабораторно оборудване и пространство на масата, тъй като такова замърсяване може да генерира фалшиво положителни (или фалшиво отрицателни) резултати.

За да се намали вероятността от заразяване, добрата лабораторна практика трябва да се прилага по всяко време.По-конкретно, трябва да се вземат предпазни мерки по отношение на следните точки:

1. Боравене с реагенти
2. Организация на работното пространство и оборудване
3. Съвети за употреба и почистване за определеното молекулярно пространство
4. Общи съвети по молекулярна биология
5. Вътрешен контрол
6. Библиография

1. Боравене с реагенти

Центрофугирайте за кратко епруветките с реагентите, преди да ги отворите, за да избегнете образуването на аерозоли.Аликвотни реагенти, за да се избегне многократно замразяване-размразяване и замърсяване на основните запаси.Ясно етикетирайте и датирайте всички реактивни и реакционни епруветки и поддържайте дневници на номерата на партидите на реагентите и партидите, използвани във всички експерименти.Пипетирайте всички реагенти и проби, като използвате филтърни накрайници.Преди закупуване е препоръчително да потвърдите с производителя, че накрайниците на филтъра отговарят на марката пипета, която ще използвате.

2. Организация на работното пространство и оборудване

Работното пространство трябва да бъде организирано така, че да се гарантира, че работният поток протича в една посока, от чисти зони (преди PCR) към мръсни зони (след PCR).Следните общи предпазни мерки ще помогнат за намаляване на вероятността от заразяване.Имайте отделни определени стаи или поне физически отделени зони за: приготвяне на мастърмикс, екстракция на нуклеинова киселина и добавяне на шаблон на ДНК, амплификация и работа с амплифициран продукт и анализ на продукта, напр. гел електрофореза.

В някои настройки е трудно да имате 4 отделни стаи.Възможна, но по-малко желана опция е подготовката на основната смес да се извърши в затворена зона, напр. шкаф с ламинарен поток.В случай на вложена PCR амплификация, подготовката на мастърмикса за реакцията от втори кръг трябва да се подготви в „чистата“ зона за подготовка на мастърмикс, но инокулацията с първичния PCR продукт трябва да се извърши в стаята за амплификация и, ако е възможно в специална зона за задържане (напр. шкаф с ламинарен поток).

Всяка стая/зона се нуждае от отделен набор от ясно обозначени пипети, филтърни накрайници, стелажи за епруветки, вортекси, центрофуги (ако е приложимо), химикалки, общи лабораторни реактиви, лабораторни престилки и кутии с ръкавици, които ще останат на съответните им работни места.Ръцете трябва да се измиват и да се сменят ръкавиците и лабораторните престилки, когато се движите между определените зони.Реагентите и оборудването не трябва да се преместват от мръсна зона в чиста зона.Ако възникне екстремен случай, при който реагент или част от оборудването трябва да се премести назад, първо трябва да се обеззарази с 10% натриев хипохлорит, последвано от избърсване със стерилна вода.

Забележка

10% разтвор на натриев хипохлорит трябва да се долива ежедневно.Когато се използва за обеззаразяване, трябва да се спазва минимално време за контакт от 10 минути.
Като алтернатива могат да се използват налични в търговската мрежа продукти, които са валидирани като разрушаващи ДНК повърхностни деконтаминанти, ако местните препоръки за безопасност не позволяват използването на натриев хипохлорит или ако натриевият хипохлорит не е подходящ за дезактивиране на металните части на оборудването.

В идеалния случай персоналът трябва да се придържа към етиката на еднопосочния работен поток и да не се връща от мръсни зони (след PCR) обратно към чисти зони (преди PCR) в същия ден.Възможно е обаче да има случаи, когато това е неизбежно.Когато възникне такъв случай, персоналът трябва да се погрижи да измие старателно ръцете, да смени ръкавиците, да използва определеното лабораторно престило и да не внася каквото и да е оборудване, което ще иска да изнесе отново от стаята, като например лабораторни книги.Такива контролни мерки трябва да бъдат подчертани в обучението на персонала по молекулярни методи.

След употреба пространствата на пейките трябва да се почистят с 10% натриев хипохлорит (последван от стерилна вода за отстраняване на остатъчната белина), 70% етанол или валидиран наличен в търговската мрежа деконтаминант, разрушаващ ДНК.В идеалния случай трябва да се монтират ултравиолетови (UV) лампи, за да се даде възможност за обеззаразяване чрез облъчване.Използването на ултравиолетови лампи обаче трябва да бъде ограничено до затворени работни зони, напр. безопасни шкафове, за да се ограничи излагането на лабораторния персонал на ултравиолетови лъчи.Моля, спазвайте инструкциите на производителя за грижа за UV лампата, вентилация и почистване, за да сте сигурни, че лампите остават ефективни.

Ако използвате 70% етанол вместо натриев хипохлорит, ще е необходимо облъчване с UV светлина за завършване на обеззаразяването.
Не почиствайте вортекса и центрофугата с натриев хипохлорит;вместо това избършете със 70% етанол и изложете на ултравиолетова светлина или използвайте търговски деконтаминант, разрушаващ ДНК.За разливи се консултирайте с производителя за допълнителни съвети за почистване.Ако инструкциите на производителя го позволяват, пипетите трябва да се стерилизират рутинно в автоклав.Ако пипетите не могат да бъдат автоклавирани, трябва да е достатъчно да ги почистите с 10% натриев хипохлорит (последвано от щателно избърсване със стерилна вода) или с търговско ДНК-унищожаващо деконтаминантно средство, последвано от UV излагане.

Почистването с високопроцентен натриев хипохлорит може в крайна сметка да повреди пластмасите и металите на пипетата, ако се извършва редовно;първо проверете препоръките на производителя.Цялото оборудване трябва да се калибрира редовно според графика, препоръчан от производителя.Определено лице трябва да отговаря за осигуряването на спазването на графика за калибриране, поддържането на подробни регистрационни файлове и ясно показване на сервизните етикети на оборудването.

3. Съвети за употреба и почистване за определеното молекулярно пространство

Предварителна PCR: Аликвотиране на реагент/приготвяне на мастърмикс: Това трябва да е най-чистото от всички пространства, използвани за подготовката на молекулярни експерименти и в идеалния случай трябва да бъде определен шкаф с ламинарен поток, оборудван с UV светлина.Проби, екстрахирана нуклеинова киселина и амплифицирани PCR продукти не трябва да се обработват в тази зона.Реагентите за амплификация трябва да се съхраняват във фризер (или хладилник, според препоръките на производителя) в същото определено място, в идеалния случай до шкафа с ламинарен поток или зоната за предварителна PCR.Ръкавиците трябва да се сменят всеки път при влизане в зоната преди PCR или в шкафа с ламинарен поток.

Зоната преди PCR или шкафът с ламинарен поток трябва да се почистват преди и след употреба, както следва: Избършете всички елементи в шкафа, напр. търговски ДНК-разрушаващ деконтаминант и оставете да изсъхне.В случай на затворена работна зона, напр. шкаф с ламинарен поток, изложете аспиратора на UV светлина за 30 минути.

Забележка

Не излагайте реагентите на UV светлина;преместете ги в шкафа само след като е чист.Ако извършвате PCR с обратна транскрипция, може също да е полезно да избършете повърхности и оборудване с разтвор, който разгражда RNases при контакт.Това може да помогне да се избегнат фалшиво-отрицателни резултати от ензимно разграждане на РНК.След обеззаразяване и преди приготвяне на мастермикса, ръкавиците трябва да се сменят още веднъж и тогава шкафът е готов за употреба.

Pre-PCR: Екстракция на нуклеинова киселина/добавяне на шаблон:

Нуклеиновата киселина трябва да бъде извлечена и обработена във втора определена зона, като се използва отделен набор от пипети, накрайници за филтри, стелажи за епруветки, свежи ръкавици, лабораторни престилки и друго оборудване. Тази зона е също така за добавяне на шаблон, контроли и линии на тенденции към mastermix тръби или плочи.За да се избегне замърсяване на извлечените проби от нуклеинова киселина, които се анализират, се препоръчва да смените ръкавиците преди работа с положителните контроли или стандарти и да използвате отделен комплект пипети.PCR реагентите и амплифицираните продукти не трябва да се пипетират в тази зона.Пробите трябва да се съхраняват в определени хладилници или фризери в същата зона.Пробното работно пространство трябва да се почисти по същия начин като пространството за мастермикс.

След PCR: Амплификация и обработка на амплифицирания продукт

Това определено пространство е за процеси след амплификация и трябва да бъде физически отделено от зоните преди PCR.Обикновено съдържа термоциклери и платформи в реално време и в идеалния случай трябва да има шкаф с ламинарен поток за добавяне на продукта от кръг 1 PCR към реакцията от кръг 2, ако се извършва вложена PCR.PCR реагентите и екстрахираната нуклеинова киселина не трябва да се обработват в тази зона, тъй като рискът от замърсяване е висок.Тази зона трябва да има отделен комплект ръкавици, лабораторни престилки, стелажи за плочи и епруветки, пипети, филтърни накрайници, контейнери и друго оборудване.Епруветките трябва да се центрофугират преди отваряне.Пробното работно пространство трябва да се почисти по същия начин като пространството за мастермикс.

След PCR: Анализ на продукта

Тази стая е за оборудване за откриване на продукти, напр. резервоари за гел електрофореза, захранващи блокове, UV трансилюминатор и система за документиране на гел.Тази зона трябва да има отделни комплекти ръкавици, лабораторни престилки, стелажи за плочи и епруветки, пипети, филтърни накрайници, контейнери и друго оборудване.Никакви други реагенти не могат да се внасят в тази зона, с изключение на зареждащото багрило, молекулярен маркер и агарозен гел и буферни компоненти.Пробното работно пространство трябва да се почисти по същия начин като пространството за мастермикс.

Важна забележка

В идеалния случай стаите преди PCR не трябва да се влизат в същия ден, ако вече е извършена работа в стаите след PCR.Ако това е напълно неизбежно, първо се уверете, че ръцете са измити старателно и че в стаите се носят специални лабораторни престилки.Лабораторните книги и документи не трябва да се носят в стаите преди PCR, ако са били използвани в стаите след PCR;ако е необходимо, вземете дублирани разпечатки на протоколи/идентификационни номера на проби и др.

4. Общи съвети по молекулярна биология

Използвайте ръкавици без пудра, за да избегнете инхибиране на анализа.Правилната техника на пипетиране е от първостепенно значение за намаляване на замърсяването.Неправилното пипетиране може да доведе до пръски при дозиране на течности и създаване на аерозоли.Добрите практики за правилно пипетиране могат да бъдат намерени на следните връзки: Ръководство за пипетиране на Gilson, видеоклипове за техниката на пипетиране на Anachem, Епруветки за центрофугиране преди отваряне и ги отваряйте внимателно, за да избегнете пръскане.Затворете епруветките веднага след употреба, за да избегнете въвеждането на замърсители.

Когато извършвате множество реакции, пригответе една основна смес, съдържаща общи реагенти (напр. вода, dNTP, буфер, праймери и ензим), за да сведете до минимум броя на прехвърлянията на реагенти и да намалите заплахата от замърсяване.Препоръчително е да поставите мастермикса върху лед или студен блок.Използването на ензим Hot Start може да помогне за намаляване на производството на неспецифични продукти.Защитете реагентите, съдържащи флуоресцентни сонди, от светлина, за да избегнете разграждане.

5. Вътрешен контрол

Включете добре охарактеризирани, потвърдени положителни и отрицателни контроли, заедно с контрола без шаблон във всички реакции и многоточкова титрувана линия на тенденция за количествени реакции.Положителната контрола не трябва да е толкова силна, че да представлява риск от заразяване.Включете положителни и отрицателни екстракционни контроли, когато извършвате екстракция на нуклеинова киселина.

Препоръчително е във всяка от зоните да бъдат публикувани ясни инструкции, така че потребителите да са запознати с правилата за поведение.Диагностичните лаборатории, които откриват много ниски нива на ДНК или РНК в клинични проби, може да искат да приемат допълнителната мярка за сигурност, като имат отделни системи за обработка на въздуха с леко положително въздушно налягане в стаите преди PCR и леко отрицателно въздушно налягане в стаите след PCR.

И накрая, разработването на план за осигуряване на качеството (QA) е полезно.Такъв план трябва да включва списъци на основни и работни запаси на реагенти, правила за съхранение на комплекти и реагенти, докладване на резултатите от контрола, програми за обучение на персонала, алгоритми за отстраняване на неизправности и коригиращи действия, когато е необходимо.

6. Библиография

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Глава 3: Създаване на qPCR лаборатория.Ръководен документ за тестване на води за отдих с помощта на USEPA qPCR метод 1611. Лансинг-Мичигански държавен университет.

Обществено здраве Англия, NHS.Стандарти на Обединеното кралство за микробиологични изследвания: Добра лабораторна практика при извършване на анализи за молекулярна амплификация).Насоки за качество.2013; 4 (4): 1–15.

Mifflin T. Създаване на PCR лаборатория.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Рутинна поддръжка на центрофуги: почистване, поддръжка и дезинфекция на центрофуги, ротори и адаптери (Бяла книга № 14).Хамбург: Eppendorf;2013.

Виана RV, Уолис CL.Добра клинична лабораторна практика (GCLP) за молекулярни тестове, използвани в диагностични лаборатории, В: Akyar I, редактор.Широк спектър на контрол на качеството.Риека, Хърватия: Intech;2011: 29–52.