Метады малекулярнага выяўлення валодаюць здольнасцю вырабляць вялікі аб'ём нуклеінавай кіслаты шляхам узмацнення слядоў, знойдзеных ва ўзорах.Нягледзячы на ​​тое, што гэта карысна для забеспячэння адчувальнага выяўлення, гэта таксама стварае магчымасць заражэння праз распаўсюджванне ўзмацняльных аэразоляў у лабараторным асяроддзі.Пры правядзенні эксперыментаў могуць быць прыняты меры, каб пазбегнуць забруджвання рэагентаў, лабараторнага абсталявання і памяшканні лаўкі, паколькі такое забруджванне можа прывесці да прытворнададатных (або прытворнаадмоўных) вынікаў.

Каб знізіць верагоднасць заражэння, неабходна ўвесь час прытрымлівацца належнай лабараторнай практыкі.У прыватнасці, варта прыняць меры засцярогі ў дачыненні да наступных момантаў:

1. Абыходжанне з рэактывамі
2. Арганізацыя працоўнай прасторы і абсталявання
3. Парады па выкарыстанні і ачыстцы для пазначанай малекулярнай прасторы
4. Агульныя парады па малекулярнай біялогіі
5. Унутраны кантроль
6. Бібліяграфія

1. Абыходжанне з рэактывамі

Ненадоўга адцэнтрыфугуйце прабіркі з рэагентамі перад адкрыццём, каб пазбегнуць адукацыі аэразоляў.Аліквотныя рэагенты, каб пазбегнуць шматразовага замарожвання-адтавання і забруджвання асноўных запасаў.Выразна маркіруйце і датуйце ўсе прабіркі з рэагентамі і рэакцыямі і вядзіце журналы нумароў партый рэагентаў, якія выкарыстоўваліся ва ўсіх эксперыментах.Пракапайце ўсе рэагенты і ўзоры з дапамогай наканечнікаў фільтра.Перад купляй пажадана пацвердзіць у вытворцы, што наканечнікі фільтра адпавядаюць марцы піпеткі, якая будзе выкарыстоўвацца.

2. Арганізацыя працоўнай прасторы і абсталявання

Працоўная прастора павінна быць арганізавана так, каб праца адбывалася ў адным кірунку, ад чыстых зон (да ПЦР) да брудных зон (пасля ПЦР).Наступныя агульныя меры засцярогі дапамогуць знізіць верагоднасць заражэння.Мець асобныя спецыяльныя памяшканні або, як мінімум, фізічна асобныя зоны для: падрыхтоўкі майстэрскай сумесі, экстракцыі нуклеінавых кіслот і дадання шаблону ДНК, ампліфікацыі і апрацоўкі ампліфікаванага прадукту і аналізу прадукту, напрыклад, электрафарэзу ў гелі.

У некаторых умовах мець 4 асобныя пакоі складана.Магчымым, але менш пажаданым варыянтам з'яўляецца падрыхтоўка майстэрскай сумесі ў закрытай зоне, напрыклад, у шафе з ламінарным патокам.У выпадку ўкладзенай ПЦР-ампліфікацыі падрыхтоўка майстармікса для рэакцыі другога раунда павінна быць падрыхтавана ў «чыстай» зоне для падрыхтоўкі майстармікса, але прышчэпка першасным ПЦР-прадуктам павінна праводзіцца ў памяшканні для ампліфікацыі і, калі магчыма у спецыяльнай зоне ўтрымання (напрыклад, у шафе з ламінарным патокам).

Кожнаму памяшканню/зоне патрэбны асобны набор піпетак з выразнай маркіроўкай, наканечнікаў фільтраў, штатываў для прабірак, вортексаў, цэнтрыфуг (пры неабходнасці), ручак, агульных лабараторных рэагентаў, лабараторных халатаў і скрынак з пальчаткамі, якія застануцца на адпаведных працоўных месцах.Пры перамяшчэнні паміж прызначанымі месцамі неабходна мыць рукі і мяняць пальчаткі і лабараторныя халаты.Рэагенты і абсталяванне нельга пераносіць з бруднай зоны ў чыстую.Калі ўзнікне надзвычайны выпадак, калі рэагент або частку абсталявання неабходна перамясціць назад, іх трэба спачатку абеззаразіць 10%-ным растворам гіпахларыту натрыю, пасля чаго працерці стэрыльнай вадой.

Нататка

10% -ный раствор гипохлорита натрыю неабходна штодня даводзіць свежы.Пры выкарыстанні для дэзактывацыі неабходна прытрымлівацца мінімальнага часу кантакту 10 хвілін.
У якасці альтэрнатывы можна выкарыстоўваць камерцыйна даступныя прадукты, якія пацверджаны як сродкі для дэзактывацыі паверхні, якія разбураюць ДНК, калі мясцовыя рэкамендацыі па бяспецы не дазваляюць выкарыстоўваць гіпахларыт натрыю або калі гіпахларыт натрыю не падыходзіць для ачысткі металічных частак абсталявання.

У ідэале персанал павінен прытрымлівацца аднанакіраванага этасу працоўнага працэсу і не вяртацца з брудных зон (пасля ПЦР) назад у чыстыя зоны (да ПЦР) у той жа дзень.Аднак могуць быць выпадкі, калі гэтага не пазбегнуць.Калі ўзнікае такая нагода, персанал павінен старанна вымыць рукі, змяніць пальчаткі, выкарыстоўваць прызначаны лабараторны халат і не прыносіць ніякага абсталявання, якое яны захочуць зноў вынесці з пакоя, напрыклад, лабараторных кніг.Такія меры кантролю павінны быць зроблены акцэнтам пры навучанні персаналу малекулярным метадам.

Пасля выкарыстання месцы на лавах трэба ачысціць 10% растворам гіпахларыту натрыю (затым стэрыльнай вадой для выдалення рэшткаў адбельвальніка), 70% этанолам або правераным камерцыйна даступным дэзінфікуючым сродкам, які разбурае ДНК.У ідэале, ультрафіялетавыя (УФ) лямпы павінны быць устаноўлены, каб забяспечыць дэзактывацыю шляхам апрамянення.Аднак выкарыстанне ўльтрафіялетавых лямпаў павінна быць абмежавана закрытымі працоўнымі памяшканнямі, напрыклад, шафамі бяспекі, каб абмежаваць уздзеянне УФ-прамянёў на персанал лабараторыі.Калі ласка, прытрымлівайцеся інструкцый вытворцы па догляду, вентыляцыі і ачыстцы УФ-лямпы, каб забяспечыць эфектыўнасць лямпаў.

Пры выкарыстанні 70% этанолу замест гіпахларыту натрыю для завяршэння дэзактывацыі спатрэбіцца апраменьванне ультрафіялетам.
Не чысціце вортекс і цэнтрыфугу гіпахларытам натрыю;замест гэтага працярыце 70% этанолам і падвяргайце ўздзеянню УФ-прамянёў або выкарыстоўвайце камерцыйны сродак для дэзактывацыі, які разбурае ДНК.У выпадку разліву пракансультуйцеся з вытворцам, каб атрымаць дадатковыя парады па ачыстцы.Калі інструкцыі вытворцы гэта дазваляюць, піпеткі неабходна рэгулярна стэрылізаваць у аўтаклаве.Калі піпеткі не могуць быць ачышчаны ў аўтаклаве, дастаткова ачысціць іх 10% гіпахларытам натрыю (з наступным дбайным выціраннем стэрыльнай вадой) або камерцыйным сродкам для дэзактывацыі, разбуральным ДНК, з наступным уздзеяннем ультрафіялетам.

Ачыстка гіпахларытам натрыю з высокім адсоткам можа ў канчатковым выніку пашкодзіць пластык піпеткі і металы, калі рабіць яе рэгулярна;спачатку праверце рэкамендацыі вытворцы.Усё абсталяванне неабходна рэгулярна калібраваць у адпаведнасці з графікам, рэкамендаваным вытворцам.Прызначаная асоба павінна адказваць за выкананне графіка каліброўкі, вядзенне падрабязных журналаў і выразнае адлюстраванне сэрвісных этыкетак на абсталяванні.

3. Парады па выкарыстанні і ачыстцы для пазначанай малекулярнай прасторы

Папярэдняя ПЦР: аліквотаванне рэагентаў / падрыхтоўка майстэрскай сумесі: гэта павінна быць самае чыстае з усіх памяшканняў, якія выкарыстоўваюцца для падрыхтоўкі малекулярных эксперыментаў, і ў ідэале гэта павінна быць спецыяльная шафа з ламінарным патокам, абсталяваная ультрафіялетавым святлом.Узоры, экстрагаваныя нуклеінавыя кіслаты і ампліфікаваныя прадукты ПЦР нельга апрацоўваць у гэтай зоне.Рэагенты для ампліфікацыі трэба захоўваць у маразільнай камеры (або халадзільніку, у адпаведнасці з рэкамендацыямі вытворцы) у тым жа адведзеным месцы, у ідэале побач з камерай з ламінарным патокам або зонай папярэдняй ПЦР.Пальчаткі неабходна мяняць кожны раз пры ўваходзе ў зону папярэдняй ПЦР або ламінарным кабінет.

Зону перад ПЦР або камеру з ламінарным патокам трэба ачысціць да і пасля выкарыстання наступным чынам: працярыце ўсе прадметы ў шафе, напрыклад, піпеткі, скрынкі для наканечнікаў, вортекс, цэнтрыфугі, штатывы для прабірак, ручкі і г.д. 70% этанолам або камерцыйны сродак для дэзактывацыі, які разбурае ДНК, і дайце высахнуць.У выпадку закрытай працоўнай зоны, напрыклад, у шафе з ламінарным патокам, падвяргайце выцяжку ўздзеянню УФ-прамянёў на 30 хвілін.

Нататка

Не падвяргайце рэагенты ўздзеянню УФ-прамянёў;перамяшчайце іх у шафу толькі пасля таго, як яна ачысціцца.Пры выкананні ПЦР са зваротнай транскрыпцыяй таксама можа быць карысна працерці паверхні і абсталяванне растворам, які расшчапляе РНКазы пры кантакце.Гэта можа дапамагчы пазбегнуць прытворнаадмоўных вынікаў ферментнай дэградацыі РНК.Пасля дэзактывацыі і перад падрыхтоўкай майстармікса пальчаткі трэба яшчэ раз змяніць, і тады шафа гатовая да выкарыстання.

Папярэдняя ПЦР: экстракцыя нуклеінавых кіслот/даданне шаблону:

Нуклеінавую кіслату неабходна здабываць і апрацоўваць у другім прызначаным месцы з выкарыстаннем асобнага набору піпетак, наканечнікаў фільтраў, штатываў для прабірак, свежых пальчатак, лабараторных халатаў і іншага абсталявання. Гэта месца таксама прызначана для дадання шаблонаў, элементаў кіравання і ліній трэнду ў трубкі або пласціны Mastermix.Каб пазбегнуць забруджвання экстрагаваных узораў нуклеінавых кіслот, якія аналізуюцца, рэкамендуецца змяніць пальчаткі перад апрацоўкай станоўчага кантролю або стандартаў і выкарыстоўваць асобны набор піпетак.ПЦР-рэагенты і прадукты ампліфікацыі нельга капаць у гэтую зону.Узоры павінны захоўвацца ў прызначаных халадзільніках або маразільніках у тым жа месцы.Працоўную вобласць узору трэба ачысціць гэтак жа, як і прастору майстармікса.

Пасля ПЦР: ампліфікацыя і апрацоўка ампліфікаванага прадукту

Гэта адведзенае месца прызначана для працэсаў пасля ампліфікацыі і павінна быць фізічна аддзелена ад зон перад ПЦР.Звычайна ён змяшчае тэрмацыклеры і платформы рэальнага часу, і ў ідэале павінен мець шафу з ламінарным патокам для дадання прадукту ПЦР 1 раунда ў рэакцыю 2 раунда, калі праводзіцца ўкладзеная ПЦР.ПЦР-рэагенты і экстрагаваныя нуклеінавыя кіслаты нельга выкарыстоўваць у гэтай зоне, паколькі рызыка заражэння высокая.У гэтай зоне павінен быць асобны набор пальчатак, лабараторных халатаў, стэлажоў для пласцін і прабірак, піпетак, наканечнікаў фільтраў, кантэйнераў і іншага абсталявання.Перад адкрыццём прабіркі неабходна центрифугировать.Працоўную вобласць узору трэба ачысціць гэтак жа, як і прастору майстармікса.

Пост-ПЦР: аналіз прадукту

Гэта памяшканне прызначана для абсталявання для выяўлення прадукту, напрыклад, рэзервуараў для электрафарэзу геля, блокаў харчавання, УФ-трансілюмінатара і сістэмы дакументацыі геля.У гэтай зоне павінны быць асобныя наборы пальчатак, лабараторных халатаў, падстаўкі для пласцін і прабірак, піпеткі, наканечнікі фільтраў, кантэйнеры і іншае абсталяванне.Ніякія іншыя рэагенты не могуць быць унесены ў гэтую зону, за выключэннем загрузнага фарбавальніка, малекулярнага маркера і агарозного геля, а таксама кампанентаў буфера.Працоўную вобласць узору трэба ачысціць гэтак жа, як і прастору майстармікса.

Важная заўвага

У ідэале нельга заходзіць у кабінеты да ПЦР у той жа дзень, калі праца ў кабінетах пасля ПЦР ужо была праведзена.Калі гэтага немагчыма пазбегнуць, пераканайцеся, што спачатку старанна вымытыя рукі і што ў пакоях надзеты спецыяльныя лабараторныя халаты.Лабараторныя кнігі і дакументы нельга браць з сабой у кабінеты да ПЦР, калі яны выкарыстоўваліся ў кабінетах пасля ПЦР;пры неабходнасці зняць дублікаты раздруковак пратаколаў/узораў і інш.

4. Агульныя парады па малекулярнай біялогіі

Выкарыстоўвайце непрыпудраныя пальчаткі, каб пазбегнуць інгібіравання аналізу.Правільная тэхніка піпетавання мае першараднае значэнне для памяншэння забруджвання.Няправільнае піпетаванне можа прывесці да распырсквання вадкасцей і ўтварэння аэразоляў.Правільную практыку правільнага піпетавання можна знайсці па наступных спасылках: Кіраўніцтва Gilson па піпетцы, Відэаролікі па тэхніцы піпетавання Anachem, Цэнтрыфужныя прабіркі перад адкрыццём і асцярожна адкрывайце іх, каб пазбегнуць пырскаў.Зачыніце прабіркі адразу пасля выкарыстання, каб пазбегнуць траплення забруджванняў.

Пры правядзенні некалькіх рэакцый прыгатуйце адзін майстар-мікс, які змяшчае звычайныя рэагенты (напрыклад, ваду, dNTP, буфер, праймеры і фермент), каб звесці да мінімуму колькасць пераносаў рэагентаў і паменшыць пагрозу заражэння.Рэкамендуецца наладжваць майстармікс на лёд або халодны блок.Выкарыстанне фермента Hot Start можа дапамагчы паменшыць выпрацоўку неспецыфічных прадуктаў.Абараняйце рэагенты, якія змяшчаюць флуоресцентные зонды, ад святла, каб пазбегнуць дэградацыі.

5. Унутраны кантроль

Уключыце добра ахарактарызаваныя, пацверджаныя станоўчыя і адмоўныя элементы кантролю, а таксама кантроль без шаблону ва ўсіх рэакцыях і шматкропкавую тытраваную лінію трэнду для колькасных рэакцый.Станоўчы кантроль не павінен быць настолькі моцным, каб ствараць рызыку заражэння.Уключыце станоўчы і адмоўны кантроль экстракцыі пры выкананні экстракцыі нуклеінавых кіслот.

Рэкамендуецца размясціць дакладныя інструкцыі ў кожнай з зон, каб карыстальнікі ведалі правілы паводзін.Дыягнастычныя лабараторыі, якія выяўляюць вельмі нізкі ўзровень ДНК або РНК у клінічных узорах, могуць прыняць дадатковую меру бяспекі, заключаючыся ў наяўнасці асобных сістэм апрацоўкі паветра са злёгку станоўчым ціскам паветра ў памяшканнях да ПЦР і злёгку адмоўным у памяшканнях пасля ПЦР.

Нарэшце, распрацоўка плана забеспячэння якасці (QA) карысная.Такі план павінен уключаць спісы асноўных запасаў рэагентаў і працоўных запасаў, правілы захоўвання набораў і рэагентаў, справаздачы аб выніках кантролю, праграмы навучання персаналу, алгарытмы ліквідацыі непаладак і меры па выпраўленні сітуацыі, калі гэта неабходна.

6. Бібліяграфія

Аслан А, Кінзелман Дж, Дрылін Э, Ананьева Т, Лавандэр Дж. Раздзел 3: Стварэнне лабараторыі qPCR.Кіраўнічы дакумент па тэсціраванні рэкрэацыйных вод з выкарыстаннем метаду qPCR USEPA 1611. Універсітэт штата Мічыган Лансінга.

Грамадскае здароўе Англіі, NHS.Стандарты Вялікабрытаніі для мікрабіялагічных даследаванняў: належная лабараторная практыка пры выкананні аналізаў малекулярнай ампліфікацыі).Кіраўніцтва па якасці.2013;4(4):1–15.

Міфлін Т. Стварэнне лабараторыі ПЦР.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Рэгламентнае тэхнічнае абслугоўванне цэнтрыфуг: ачыстка, абслугоўванне і дэзінфекцыя цэнтрыфуг, ротараў і адаптараў (Белая кніга № 14).Гамбург: Эпендорф;2013 год.

Viana RV, Уоліс CL.Належная клінічная лабараторная практыка (GCLP) для малекулярных тэстаў, якія выкарыстоўваюцца ў дыягнастычных лабараторыях, у: Akyar I, рэдактар.Шырокі спектр кантролю якасці.Рыека, Харватыя: Intech;2011: 29–52.