Molekulyar aşkarlama üsulları nümunələrdə tapılan iz miqdarlarının gücləndirilməsi yolu ilə böyük həcmdə nuklein turşusu istehsal etmək qabiliyyətinə malikdir.Bu, həssas aşkarlamağa imkan vermək üçün faydalı olsa da, laboratoriya mühitində gücləndirici aerozolların yayılması ilə çirklənmə ehtimalını da təqdim edir.Təcrübələr apararkən reagentlərin, laboratoriya avadanlığının və dəzgah sahəsinin çirklənməsinin qarşısını almaq üçün tədbirlər görülə bilər, belə çirklənmə yalan-müsbət (yaxud yanlış-mənfi) nəticələr yarada bilər.

Çirklənmə ehtimalını azaltmağa kömək etmək üçün Yaxşı Laboratoriya Təcrübəsi hər zaman həyata keçirilməlidir.Xüsusilə, aşağıdakı məqamlarla bağlı ehtiyat tədbirləri görülməlidir:

1. Reagentlərlə işləmək
2. İş yerinin və avadanlıqların təşkili
3. Təyin olunmuş molekulyar məkan üçün istifadə və təmizləmə məsləhətləri
4. Ümumi molekulyar biologiya məsləhəti
5. Daxili nəzarət
6. Biblioqrafiya

1. Reagentlərlə işləmək

Aerozolların yaranmasının qarşısını almaq üçün reagent borularını açmadan əvvəl qısa müddətə sentrifuqa edin.Çoxlu donma-ərimələrin və əsas ehtiyatların çirklənməsinin qarşısını almaq üçün reagentlərin hissələri.Bütün reagent və reaksiya borularını aydın şəkildə etiketləyin və tarixləyin və bütün təcrübələrdə istifadə olunan reagent partiyası və partiya nömrələrinin qeydlərini aparın.Filtr uclarından istifadə edərək bütün reagentləri və nümunələri pipetlə çəkin.Satın almadan əvvəl istehsalçı ilə filtr uclarının istifadə ediləcək pipet markasına uyğun olduğunu təsdiqləmək məsləhətdir.

2. İş yerinin və avadanlıqların təşkili

İş sahəsi təmiz ərazilərdən (PZR öncəsi) çirkli ərazilərə (PZR sonrası) qədər iş axınının bir istiqamətdə baş verməsini təmin etmək üçün təşkil edilməlidir.Aşağıdakı ümumi ehtiyat tədbirləri çirklənmə ehtimalını azaltmağa kömək edəcək.Ayrı-ayrı təyin edilmiş otaqlara və ya minimum fiziki cəhətdən ayrı sahələrə sahib olun: mastermiksin hazırlanması, nuklein turşusunun çıxarılması və DNT şablonunun əlavə edilməsi, gücləndirilmiş məhsulun gücləndirilməsi və işlənməsi və məhsulun təhlili, məsələn, gel elektroforezi.

Bəzi şəraitdə 4 ayrı otağın olması çətindir.Mümkün, lakin daha az arzuolunan variant, mastermiksin hazırlanmasını mühafizə zonasında, məsələn, laminar axın şkafında etməkdir.İç-içə PZR gücləndirilməsi vəziyyətində, ikinci tur reaksiyası üçün mastermiksin hazırlanması mastermiksin hazırlanması üçün "təmiz" sahədə hazırlanmalıdır, lakin ilkin PZR məhsulu ilə aşılama gücləndirmə otağında aparılmalıdır və mümkünsə. xüsusi saxlama sahəsində (məsələn, laminar axın şkafı).

Hər bir otaq/sahəyə müvafiq iş stansiyalarında qalacaq ayrıca aydın etiketli pipetkalar, filtr ucları, boru rəfləri, burulğanlar, sentrifuqalar (əgər müvafiq olarsa), qələmlər, ümumi laboratoriya reagentləri, laboratoriya paltarları və əlcək qutuları lazımdır.Təyin olunmuş ərazilər arasında hərəkət edərkən əllər yuyulmalı, əlcəklər və laboratoriya paltarları dəyişdirilməlidir.Reagentlər və avadanlıqlar çirkli yerdən təmiz əraziyə köçürülməməlidir.Reagent və ya avadanlığın geriyə daşınması lazım olan ekstremal vəziyyət yaranarsa, o, əvvəlcə 10% natrium hipoxloritlə dezinfeksiya edilməli, sonra isə steril su ilə silinməlidir.

Qeyd

10% natrium hipoxlorit məhlulu hər gün təzə hazırlanmalıdır.Dezinfeksiya üçün istifadə edildikdə, minimum 10 dəqiqəlik təmas müddətinə riayət edilməlidir.
Alternativ olaraq, yerli təhlükəsizlik tövsiyələri natrium hipoxloritdən istifadəyə icazə vermədikdə və ya natrium hipoxlorit avadanlığın metal hissələrini zərərsizləşdirmək üçün uyğun deyilsə, DNT-ni məhv edən səthi dekontaminantlar kimi təsdiqlənmiş kommersiya məhsullarından istifadə edilə bilər.

İdeal olaraq, işçilər biristiqamətli iş axını etikasına riayət etməli və eyni gündə çirkli ərazilərdən (PZR sonrası) təmiz ərazilərə (PZR öncəsi) qayıtmamalıdırlar.Ancaq bunun qaçınılmaz olduğu hallar ola bilər.Belə bir vəziyyət yarandıqda, işçilər əlləri hərtərəfli yumaq, əlcəkləri dəyişmək, təyin olunmuş laboratoriya paltarından istifadə etmək və laboratoriya kitabları kimi otaqdan çıxarmaq istədikləri hər hansı bir avadanlığı yenidən təqdim etməmək üçün diqqətli olmalıdırlar.Molekulyar metodlar üzrə kadr hazırlığında bu cür nəzarət tədbirləri vurğulanmalıdır.

İstifadədən sonra dəzgah boşluqları 10% natrium hipoxlorit (qalıq ağartıcını çıxarmaq üçün steril su ilə), 70% etanol və ya təsdiqlənmiş DNT-ni məhv edən dekontaminantla təmizlənməlidir.İdeal olaraq, şüalanma yolu ilə zərərsizləşdirməni təmin etmək üçün ultrabənövşəyi (UV) lampalar quraşdırılmalıdır.Bununla belə, laboratoriya işçilərinin ultrabənövşəyi şüalara məruz qalmasını məhdudlaşdırmaq üçün UV lampalarının istifadəsi qapalı iş yerlərində, məsələn, təhlükəsizlik şkaflarında məhdudlaşdırılmalıdır.Lampaların effektiv qalmasını təmin etmək üçün lütfən, UV lampasına qulluq, havalandırma və təmizləmə ilə bağlı istehsalçı təlimatlarına əməl edin.

Natrium hipoxlorit əvəzinə 70% etanol istifadə edilərsə, zərərsizləşdirməni başa çatdırmaq üçün UV işığı ilə şüalanma tələb olunacaq.
Burulğanı təmizləməyin və natrium hipoklorit ilə sentrifuqa edin;əvəzinə 70% etanol ilə silin və UV işığına məruz qoyun və ya kommersiya DNT-ni məhv edən dekontaminantdan istifadə edin.Tökülmə üçün əlavə təmizləmə məsləhətləri üçün istehsalçı ilə əlaqə saxlayın.İstehsalçı təlimatları buna icazə verirsə, pipetlər müntəzəm olaraq avtoklavda sterilizasiya edilməlidir.Əgər pipetləri avtoklavlamaq mümkün deyilsə, onları 10% natrium hipoxloritlə (sonra steril su ilə hərtərəfli silməklə) və ya DNT-ni məhv edən kommersiya dekontaminantı və ardınca UV şüası ilə təmizləmək kifayətdir.

Yüksək faizli natrium hipoxlorit ilə təmizləmə müntəzəm olaraq aparılarsa, nəticədə pipet plastiklərinə və metallara zərər verə bilər;əvvəlcə istehsalçının tövsiyələrini yoxlayın.Bütün avadanlıq istehsalçının tövsiyə etdiyi cədvələ uyğun olaraq müntəzəm olaraq kalibrlənməlidir.Təyin olunmuş şəxs kalibrləmə cədvəlinə riayət olunmasına, ətraflı jurnalların aparılmasına və avadanlıqda xidmət etiketlərinin aydın şəkildə göstərilməsinə cavabdeh olmalıdır.

3. Təyin olunmuş molekulyar məkan üçün istifadə və təmizləmə məsləhətləri

Pre-PZR: Reagentin alikotasiyası / mastermiksin hazırlanması: Bu, molekulyar təcrübələrin hazırlanması üçün istifadə edilən bütün boşluqların ən təmizi olmalıdır və ideal olaraq UV işığı ilə təchiz olunmuş təyin edilmiş laminar axın şkafı olmalıdır.Nümunələr, ekstraksiya edilmiş nuklein turşusu və gücləndirilmiş PCR məhsulları bu sahədə işlənilməməlidir.Gücləndirici reagentlər dondurucuda (və ya istehsalçının tövsiyələrinə uyğun olaraq soyuducuda) eyni təyin olunmuş yerdə, ideal olaraq laminar axın şkafının və ya pre-PZR sahəsinin yanında saxlanılmalıdır.Əlcəklər hər dəfə pre-PZR sahəsinə və ya laminar axın şkafına daxil olduqda dəyişdirilməlidir.

Pre-PZR sahəsi və ya laminar axın şkafı istifadə etməzdən əvvəl və sonra aşağıdakı kimi təmizlənməlidir: Şkafdakı bütün əşyaları, məsələn, pipetləri, uc qutularını, burulğanı, sentrifuqanı, boru rəflərini, qələmləri və s. 70% etanol və ya su ilə silin. kommersiya DNT-ni məhv edən dekontaminant və qurumağa icazə verin.Qapalı iş sahəsi, məsələn, laminar axın şkafı vəziyyətində, kapotu 30 dəqiqə UV işığına buraxın.

Qeyd

Reagentləri ultrabənövşəyi şüalara məruz qoymayın;onları yalnız təmiz olduqdan sonra kabinetə köçürün.Əgər tərs transkripsiya PCR həyata keçirirsinizsə, təmasda RNazları parçalayan məhlul ilə səthləri və avadanlıqları silmək də faydalı ola bilər.Bu, RNT-nin ferment deqradasiyası nəticəsində yanlış mənfi nəticələrin qarşısını almağa kömək edə bilər.Zərərsizləşdirildikdən sonra və mastermiksi hazırlamazdan əvvəl əlcəklər bir daha dəyişdirilməlidir, sonra şkaf istifadəyə hazırdır.

Pre-PCR: Nuklein turşusunun çıxarılması/şablon əlavəsi:

Nuklein turşusu ayrıca pipetlər, filtr ucları, boru rəfləri, təzə əlcəklər, laboratoriya paltarları və digər avadanlıqlardan istifadə etməklə, ikinci təyin olunmuş sahədə çıxarılmalı və işlənməlidir. Bu sahə həm də şablon, nəzarət elementləri və tendensiya xətlərinin əlavə edilməsi üçündür. mastermix boruları və ya plitələr.Təhlil edilən çıxarılan nuklein turşusu nümunələrinin çirklənməsinin qarşısını almaq üçün müsbət nəzarət və ya standartlarla işləməzdən əvvəl əlcəkləri dəyişdirmək və ayrıca pipetlər dəstindən istifadə etmək tövsiyə olunur.PCR reagentləri və gücləndirilmiş məhsullar bu sahədə pipetlə vurulmamalıdır.Nümunələr eyni ərazidə təyin olunmuş soyuducu və ya dondurucularda saxlanmalıdır.Nümunə iş sahəsi mastermiks sahəsi ilə eyni şəkildə təmizlənməlidir.

Post-PCR: Gücləndirilmiş məhsulun gücləndirilməsi və işlənməsi

Bu təyin olunmuş yer post-amplifikasiya prosesləri üçündür və fiziki olaraq PCR-dən əvvəlki sahələrdən ayrı olmalıdır.O, adətən termosikllər və real vaxt platformalarını ehtiva edir və ideal olaraq, yuvalanmış PCR həyata keçirilirsə, raund 1 PCR məhsulunu raund 2 reaksiyasına əlavə etmək üçün laminar axın şkafına malik olmalıdır.Çirklənmə riski yüksək olduğu üçün PCR reagentləri və ekstraksiya edilmiş nuklein turşusu bu sahədə işlənilməməlidir.Bu sahədə ayrıca əlcəklər, laboratoriya paltarları, boşqab və boru rəfləri, pipetkalar, filtr ucları, qutular və digər avadanlıqlar olmalıdır.Borular açılmazdan əvvəl sentrifuqa edilməlidir.Nümunə iş sahəsi mastermiks sahəsi ilə eyni şəkildə təmizlənməlidir.

Post-PCR: Məhsulun təhlili

Bu otaq məhsul aşkarlama avadanlığı, məsələn, gel elektroforez çənləri, enerji paketləri, UV transilluminator və gel sənədləşdirmə sistemi üçündür.Bu sahədə ayrıca əlcəklər, laboratoriya paltarları, boşqab və boru rəfləri, pipetlər, filtr ucları, qutular və digər avadanlıqlar olmalıdır.Yükləmə boyası, molekulyar marker və agaroza geli və tampon komponentləri istisna olmaqla, bu sahəyə başqa heç bir reagent gətirilə bilməz.Nümunə iş sahəsi mastermiks sahəsi ilə eyni şəkildə təmizlənməlidir.

Vacib qeyd

İdeal olaraq, əgər post-PZR otaqlarında iş artıq yerinə yetirilibsə, PZR-dən əvvəlki otaqlara eyni gündə daxil edilməməlidir.Bu tamamilə qaçınılmazdırsa, əvvəlcə əllərin hərtərəfli yuyulduğundan və otaqlarda xüsusi laboratoriya paltarlarının geyildiyindən əmin olun.Laboratoriya dəftərləri və sənədlər PCR-dən sonrakı otaqlarda istifadə olunubsa, əvvəlcədən PZR otaqlarına aparılmamalıdır;lazım gələrsə, protokolların/nümunə identifikatorlarının dublikat çapını götürün və s.

4. Ümumi molekulyar biologiya məsləhəti

Təhlilin qarşısını almaq üçün tozsuz əlcəklərdən istifadə edin.Çirklənməni azaltmaq üçün düzgün pipetləmə texnikası vacibdir.Yanlış pipetləmə mayelərin paylanması zamanı sıçrama və aerozolların yaranması ilə nəticələnə bilər.Düzgün pipetləmə üçün yaxşı təcrübəni aşağıdakı linklərdə tapa bilərsiniz: Gilson pipetting üçün bələdçi, Anachem pipetting texnikası videoları, boruları açmazdan əvvəl sentrifuqa edin və sıçramamaq üçün onları diqqətlə açın.Çirkləndiricilərin daxil olmasının qarşısını almaq üçün istifadə edildikdən dərhal sonra boruları bağlayın.

Çoxsaylı reaksiyalar həyata keçirərkən, reagent köçürmələrinin sayını minimuma endirmək və çirklənmə təhlükəsini azaltmaq üçün ümumi reagentlərdən (məsələn, su, dNTP-lər, bufer, primerlər və ferment) ibarət bir mastermiks hazırlayın.Mastermix-i buz və ya soyuq blokda qurmaq tövsiyə olunur.İsti başlanğıc fermentinin istifadəsi qeyri-spesifik məhsulların istehsalını azaltmağa kömək edə bilər.Tərkibində floresan zondlar olan reagentləri deqradasiyanın qarşısını almaq üçün işıqdan qoruyun.

5. Daxili nəzarət

Bütün reaksiyalarda şablonsuz nəzarət və kəmiyyət reaksiyaları üçün çox nöqtəli titrlənmiş trend xətti ilə birlikdə yaxşı xarakterizə edilmiş, təsdiqlənmiş müsbət və mənfi nəzarətləri daxil edin.Müsbət nəzarət çirklənmə riski yarada biləcək qədər güclü olmamalıdır.Nuklein turşusu ekstraksiyasını həyata keçirərkən müsbət və mənfi ekstraksiya nəzarətlərini daxil edin.

İstifadəçilərin davranış qaydalarından xəbərdar olması üçün hər bir sahədə aydın təlimatların yerləşdirilməsi tövsiyə olunur.Klinik nümunələrdə çox aşağı DNT və ya RNT səviyyələrini aşkar edən diaqnostik laboratoriyalar, PCR-dən əvvəlki otaqlarda bir qədər müsbət hava təzyiqi və PCR-dən sonrakı otaqlarda bir qədər mənfi hava təzyiqi olan ayrı-ayrı hava idarəetmə sistemlərinin olması kimi əlavə təhlükəsizlik tədbirini qəbul etmək istəyə bilər.

Nəhayət, keyfiyyət təminatı (QA) planının hazırlanması faydalıdır.Belə plana reagent əsas ehtiyatlarının və işçi ehtiyatlarının siyahıları, dəstlərin və reagentlərin saxlanması qaydaları, nəzarət nəticələrinin hesabatı, işçi heyətinin təlim proqramları, nasazlıqların aradan qaldırılması alqoritmləri və lazım olduqda düzəldici tədbirlər daxil edilməlidir.

6. Biblioqrafiya

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Fəsil 3: qPCR laboratoriyasının qurulması.USEPA qPCR metodundan istifadə edərək rekreasiya sularının sınaqdan keçirilməsi üçün təlimat sənədi 1611. Lansing-Michigan State University.

İngiltərə Xalq Sağlamlığı, NHS.Mikrobiologiya tədqiqatları üçün Böyük Britaniya standartları: Molekulyar gücləndirmə analizlərini yerinə yetirərkən yaxşı laboratoriya təcrübəsi).Keyfiyyət Rəhbərliyi.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. PCR laboratoriyasının qurulması.Soyuq Bahar Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Sentrifuqalara müntəzəm texniki qulluq: sentrifuqaların, rotorların və adapterlərin təmizlənməsi, saxlanması və dezinfeksiyası (White paper No. 14).Hamburq: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Diaqnostik laboratoriyalarda istifadə olunan molekulyar əsaslı testlər üçün Yaxşı Klinik Laboratoriya Təcrübəsi (GCLP), In: Akyar I, redaktor.Keyfiyyətə nəzarətin geniş spektri.Rijeka, Xorvatiya: Intech;2011: 29–52.