تمتلك طرق الكشف الجزيئي القدرة على إنتاج كمية كبيرة من الحمض النووي من خلال تضخيم الكميات النزرة الموجودة في العينات.في حين أن هذا مفيد لتمكين الكشف الحساس ، فإنه يقدم أيضًا إمكانية التلوث من خلال انتشار الهباء الجوي التضخمي في بيئة المختبر.عند إجراء التجارب ، يمكن اتخاذ تدابير لتجنب تلوث الكواشف ومعدات المختبرات ومساحة مقاعد البدلاء ، حيث قد يؤدي هذا التلوث إلى نتائج إيجابية كاذبة (أو سلبية كاذبة).

للمساعدة في تقليل احتمالية التلوث ، يجب ممارسة الممارسات المعملية الجيدة في جميع الأوقات.على وجه التحديد ، يجب اتخاذ الاحتياطات فيما يتعلق بالنقاط التالية:

1. التعامل مع الكواشف
2. تنظيم مساحة العمل والمعدات
3. نصائح الاستخدام والتنظيف للمساحة الجزيئية المعينة
4. نصائح عامة حول البيولوجيا الجزيئية
5. الضوابط الداخلية
6. ببليوغرافيا

1. التعامل مع الكواشف

أنابيب كاشف الطرد المركزي لفترة وجيزة قبل فتحها لتجنب توليد الهباء الجوي.الكواشف الكواشف لتجنب تجميد الذوبان المتعدد وتلوث المخزونات الرئيسية.قم بتسمية جميع الكواشف وأنابيب التفاعل وتاريخها بوضوح واحتفظ بسجلات دفعة الكاشف وأرقام الدُفعات المستخدمة في جميع التجارب.ماصة جميع الكواشف والعينات باستخدام أطراف التصفية.قبل الشراء ، يُنصح بالتأكد من الشركة المصنعة أن أطراف المرشح تناسب العلامة التجارية للماصة المراد استخدامها.

2. تنظيم مساحة العمل والمعدات

يجب تنظيم مساحة العمل لضمان تدفق العمل في اتجاه واحد ، من المناطق النظيفة (قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل) إلى المناطق المتسخة (ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل).ستساعد الاحتياطات العامة التالية في تقليل فرصة التلوث.لها غرف منفصلة ، أو على الأقل مناطق منفصلة ماديًا ، من أجل: تحضير الخليط الرئيسي ، واستخراج الحمض النووي وإضافة قالب الحمض النووي ، والتضخيم والتعامل مع المنتج المكبر ، وتحليل المنتج ، مثل الرحلان الكهربائي للهلام.

في بعض الأماكن ، يكون وجود 4 غرف منفصلة أمرًا صعبًا.هناك خيار محتمل ولكنه غير مرغوب فيه وهو القيام بتحضير الخلطة الرئيسية في منطقة احتواء ، على سبيل المثال خزانة التدفق الرقائقي.في حالة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل ، يجب تحضير الخليط الرئيسي لتفاعل الجولة الثانية في المنطقة "النظيفة" لتحضير الخلطة الرئيسية ، ولكن يجب إجراء التلقيح بمنتج PCR الأساسي في غرفة التضخيم ، وإذا أمكن في منطقة احتواء مخصصة (مثل خزانة التدفق الصفحي).

تحتاج كل غرفة / منطقة إلى مجموعة منفصلة من الماصات ذات العلامات الواضحة ، ونصائح المرشح ، ورفوف الأنبوب ، والدوامات ، وأجهزة الطرد المركزي (إذا كان ذلك مناسبًا) ، والأقلام ، وكواشف المختبر العامة ، ومعاطف المختبر ، وصناديق القفازات التي ستبقى في محطات العمل الخاصة بها.يجب غسل اليدين وتغيير القفازات ومعاطف المختبر عند التنقل بين المناطق المحددة.لا ينبغي نقل الكواشف والمعدات من منطقة قذرة إلى منطقة نظيفة.في حالة ظهور حالة قصوى حيث يلزم تحريك كاشف أو قطعة من المعدات للخلف ، يجب أولاً إزالة التلوث بهيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 10٪ ، ثم مسحه بالماء المعقم.

ملحوظة

يجب تحضير محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 10٪ طازجًا يوميًا.عند استخدامه لإزالة التلوث ، يجب الالتزام بحد أدنى من وقت التلامس وهو 10 دقائق.
بدلاً من ذلك ، يمكن استخدام المنتجات المتاحة تجاريًا التي تم التحقق من صحتها كمطهرات سطحية مدمرة للحمض النووي إذا كانت توصيات السلامة المحلية لا تسمح باستخدام هيبوكلوريت الصوديوم أو إذا كان هيبوكلوريت الصوديوم غير مناسب لتطهير الأجزاء المعدنية من المعدات.

من الناحية المثالية ، يجب على الموظفين الالتزام بأخلاقيات تدفق العمل أحادي الاتجاه وعدم الانتقال من المناطق المتسخة (ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل) إلى المناطق النظيفة (قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل) في نفس اليوم.ومع ذلك ، قد تكون هناك مناسبات لا مفر منها.عند ظهور مثل هذه المناسبة ، يجب على الموظفين الحرص على غسل اليدين جيدًا وتغيير القفازات واستخدام معطف المختبر المخصص وعدم إدخال أي معدات يرغبون في إخراجها من الغرفة مرة أخرى ، مثل كتب المختبر.يجب التأكيد على تدابير التحكم هذه في تدريب الموظفين على الأساليب الجزيئية.

بعد الاستخدام ، يجب تنظيف المساحات المخصصة للجلوس باستخدام 10٪ هيبوكلوريت الصوديوم (متبوعًا بالماء المعقم لإزالة المبيض المتبقي) ، أو 70٪ من الإيثانول ، أو مطهر مدمر للحمض النووي مصدق عليه تجاريًا.من الناحية المثالية ، ينبغي تركيب مصابيح الأشعة فوق البنفسجية (UV) لتمكين إزالة التلوث عن طريق التشعيع.ومع ذلك ، يجب أن يقتصر استخدام مصابيح الأشعة فوق البنفسجية على مناطق العمل المغلقة ، مثل خزانات الأمان ، من أجل الحد من تعرض طاقم المختبر للأشعة فوق البنفسجية.يرجى الالتزام بتعليمات الشركة المصنعة للعناية بمصابيح الأشعة فوق البنفسجية والتهوية والتنظيف من أجل ضمان بقاء المصابيح فعالة.

في حالة استخدام 70٪ من الإيثانول بدلاً من هيبوكلوريت الصوديوم ، ستكون هناك حاجة إلى التشعيع بضوء الأشعة فوق البنفسجية لإكمال عملية إزالة التلوث.
لا تنظف الدوامة وجهاز الطرد المركزي بهيبوكلوريت الصوديوم ؛بدلاً من ذلك ، امسح باستخدام 70٪ من الإيثانول وتعريضه للأشعة فوق البنفسجية ، أو استخدم مطهرًا تجاريًا مدمرًا للحمض النووي.بالنسبة للانسكابات ، راجع الشركة المصنعة للحصول على مزيد من النصائح حول التنظيف.إذا سمحت تعليمات الشركة المصنعة بذلك ، يجب تعقيم الماصات بشكل روتيني بواسطة الأوتوكلاف.إذا تعذر تعقيم الماصات بالبخار المضغوط ، يكفي تنظيفها بنسبة 10٪ هيبوكلوريت الصوديوم (متبوعًا بمسح شامل بالماء المعقم) أو بمطهر تجاري مدمر للحمض النووي متبوعًا بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية.

قد يؤدي التنظيف باستخدام هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة عالية في النهاية إلى إتلاف البلاستيك والمعادن بالماصة إذا تم القيام به على أساس منتظم ؛تحقق من توصيات الشركة المصنعة أولاً.يجب معايرة جميع المعدات بانتظام وفقًا للجدول الزمني الموصى به من الشركة المصنعة.يجب أن يكون الشخص المعين مسؤولاً عن ضمان الالتزام بجدول المعايرة ، والحفاظ على السجلات التفصيلية ، وعرض ملصقات الخدمة بوضوح على المعدات.

3. نصائح الاستخدام والتنظيف للمساحة الجزيئية المعينة

ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل (Pre-PCR): قسمة الكاشف / تحضير الخليط الأساسي: يجب أن يكون هذا هو أنظف جميع المساحات المستخدمة لإعداد التجارب الجزيئية ويجب أن يكون بشكل مثالي خزانة تدفق صفائحية مخصصة ومجهزة بضوء الأشعة فوق البنفسجية.يجب عدم التعامل مع العينات والحمض النووي المستخرج ومنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في هذا المجال.يجب حفظ كواشف التضخيم في المجمد (أو الثلاجة ، وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة) في نفس المساحة المخصصة ، بشكل مثالي بجوار خزانة التدفق الصفحي أو منطقة ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل.يجب تغيير القفازات في كل مرة عند دخول منطقة ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل أو خزانة التدفق الصفحي.

يجب تنظيف منطقة ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل أو خزانة التدفق الصفحي قبل الاستخدام وبعده على النحو التالي: امسح جميع العناصر الموجودة في الخزانة ، على سبيل المثال الماصات ، وصناديق الأطراف ، والدوامة ، وأجهزة الطرد المركزي ، ورفوف الأنبوب ، والأقلام ، وما إلى ذلك باستخدام 70٪ من الإيثانول أو مطهر تجاري مدمر للحمض النووي ، ويسمح ليجف.في حالة منطقة العمل المغلقة ، مثل خزانة التدفق الصفحي ، قم بتعريض الغطاء لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.

ملحوظة

لا تعرض الكواشف لضوء الأشعة فوق البنفسجية ؛انقلهم فقط إلى الخزانة بمجرد تنظيفها.في حالة إجراء نسخ عكسي لـ PCR ، قد يكون من المفيد أيضًا مسح الأسطح والمعدات بمحلول يكسر RNases عند التلامس.قد يساعد هذا في تجنب النتائج السلبية الكاذبة من تحلل إنزيم الحمض النووي الريبي.بعد إزالة التلوث وقبل تحضير المزيج الرئيسي ، يجب تغيير القفازات مرة أخرى ، وبعد ذلك تصبح الخزانة جاهزة للاستخدام.

ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل: استخراج الحمض النووي / إضافة القالب:

يجب استخراج الحمض النووي ومعالجته في منطقة محددة ثانية ، باستخدام مجموعة منفصلة من الماصات ، ونصائح المرشح ، ورفوف الأنبوب ، والقفازات الطازجة ، ومعاطف المختبر ، وغيرها من المعدات. أنابيب أو لوحات Mastermix.لتجنب تلوث عينات الحمض النووي المستخرجة التي يتم تحليلها ، يوصى بتغيير القفازات قبل التعامل مع الضوابط أو المعايير الإيجابية واستخدام مجموعة منفصلة من الماصات.يجب عدم استخدام كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والمنتجات المضخمة في هذه المنطقة.يجب تخزين العينات في ثلاجات أو مجمدات مخصصة في نفس المنطقة.يجب تنظيف مساحة عمل العينة بنفس طريقة تنظيف مساحة Mastermix.

ما بعد PCR: تضخيم ومعالجة المنتج المضخم

هذه المساحة المخصصة لعمليات ما بعد التضخيم ويجب أن تكون منفصلة ماديًا عن مناطق ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل.عادةً ما تحتوي على معالجات حرارية ومنصات في الوقت الفعلي ، ومن الناحية المثالية يجب أن تحتوي على خزانة تدفق صفائحي لإضافة منتج جولة 1 PCR إلى تفاعل الجولة 2 ، إذا تم تنفيذ PCR المتداخلة.يجب عدم التعامل مع كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل والحمض النووي المستخلص في هذه المنطقة لأن خطر التلوث مرتفع.يجب أن تحتوي هذه المنطقة على مجموعة منفصلة من القفازات ، ومعاطف المختبر ، ورفوف الألواح والأنبوب ، والماصات ، وأطراف الفلتر ، والصناديق وغيرها من المعدات.يجب طرد الأنابيب قبل فتحها.يجب تنظيف مساحة عمل العينة بنفس طريقة تنظيف مساحة Mastermix.

Post-PCR: تحليل المنتج

هذه الغرفة مخصصة لمعدات الكشف عن المنتجات ، مثل خزانات الرحلان الكهربائي للهلام وحزم الطاقة وضوء الأشعة فوق البنفسجية ونظام التوثيق الهلامي.يجب أن تحتوي هذه المنطقة على مجموعات منفصلة من القفازات ومعاطف المختبر ورفوف الألواح والأنبوب والماصات وأطراف المرشح والصناديق وغيرها من المعدات.لا يمكن إحضار أي كواشف أخرى إلى هذه المنطقة ، باستثناء صبغة التحميل والعلامة الجزيئية وهلام الاغاروز ومكونات العازلة.يجب تنظيف مساحة عمل العينة بنفس طريقة تنظيف مساحة Mastermix.

ملاحظة مهمة

من الناحية المثالية ، لا ينبغي إدخال غرف ما قبل PCR في نفس اليوم إذا تم تنفيذ العمل بالفعل في غرف ما بعد PCR.إذا كان هذا أمرًا لا مفر منه تمامًا ، فتأكد من غسل اليدين جيدًا أولاً وأن معاطف المختبر المحددة تُلبس في الغرف.يجب عدم أخذ كتب المختبر والأوراق إلى غرف ما قبل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل إذا تم استخدامها في غرف ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ؛إذا لزم الأمر ، خذ نسخ مطبوعة مكررة من البروتوكولات / نماذج المعرفات ، إلخ.

4. نصائح عامة حول البيولوجيا الجزيئية

استخدم قفازات خالية من المسحوق لتجنب تثبيط المقايسة.تعتبر تقنية الماصات الصحيحة أمرًا بالغ الأهمية لتقليل التلوث.يمكن أن يؤدي استخدام الماصات غير الصحيحة إلى تناثر السوائل عند توزيع السوائل وإنشاء الهباء الجوي.يمكن العثور على الممارسات الجيدة لسحب العينات الصحيحة على الروابط التالية: دليل Gilson لسحب العينات ، ومقاطع فيديو تقنية Anachem لسحب العينات ، وأنابيب الطرد المركزي قبل الفتح ، وافتحها بعناية لتجنب تناثر السوائل.أغلق الأنابيب مباشرة بعد الاستخدام لتجنب دخول الملوثات.

عند إجراء تفاعلات متعددة ، قم بإعداد مزيج رئيسي واحد يحتوي على الكواشف الشائعة (مثل الماء ، dNTPs ، المخزن المؤقت ، البادئات والإنزيم) لتقليل عدد عمليات نقل الكاشف وتقليل خطر التلوث.يوصى بإعداد Mastermix على الجليد أو كتلة باردة.قد يساعد استخدام إنزيم Hot Start في تقليل إنتاج منتجات غير محددة.حماية الكواشف المحتوية على مجسات الفلورسنت من الضوء لتجنب تدهورها.

5. الضوابط الداخلية

قم بتضمين عناصر تحكم إيجابية وسلبية جيدة التوصيف ومؤكدة ، إلى جانب عنصر تحكم بدون قالب في جميع التفاعلات ، وخط اتجاه معاير متعدد النقاط للتفاعلات الكمية.لا ينبغي أن تكون السيطرة الإيجابية قوية لدرجة أنها تشكل خطر التلوث.قم بتضمين عناصر تحكم الاستخراج الإيجابية والسلبية عند إجراء استخلاص الحمض النووي.

يوصى بنشر تعليمات واضحة في كل منطقة حتى يكون المستخدمون على دراية بقواعد السلوك.قد ترغب المختبرات التشخيصية التي تكشف عن مستويات منخفضة جدًا من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي في العينات السريرية في اعتماد تدبير أمني إضافي لوجود أنظمة منفصلة للتعامل مع الهواء مع ضغط هواء إيجابي قليلاً في غرف ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل وضغط هواء سلبي قليلاً في غرف ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل.

أخيرًا ، يعد تطوير خطة ضمان الجودة (QA) مفيدًا.يجب أن تتضمن هذه الخطة قوائم بمخزون الكاشف الرئيسي ومخزونات العمل ، وقواعد تخزين المجموعات والكواشف ، والإبلاغ عن نتائج التحكم ، وبرامج تدريب الموظفين ، وخوارزميات استكشاف الأخطاء وإصلاحها ، والإجراءات العلاجية عند الحاجة.

6. ببليوغرافيا

أصلان أ ، كينزيلمان ج ، دريلين إي ، أنانيفا تي ، لافاندر ج. الفصل 3: إنشاء مختبر qPCR.وثيقة إرشادية لاختبار المياه الترفيهية باستخدام طريقة USEPA qPCR 1611. لانسينغ- جامعة ولاية ميشيغان.

الصحة العامة في إنجلترا ، NHS.معايير المملكة المتحدة لتحقيقات علم الأحياء الدقيقة: الممارسة المعملية الجيدة عند إجراء فحوصات التضخيم الجزيئي).إرشادات الجودة.2013 ؛ 4 (4): 1-15.

Mifflin T. إنشاء مختبر تفاعل البوليميراز المتسلسل.كولد سبرينج حرب بروتوك.2007 ؛ 7.

Schroeder S 2013. الصيانة الروتينية لأجهزة الطرد المركزي: تنظيف وصيانة وتطهير أجهزة الطرد المركزي والدوارات والمحولات (الورقة البيضاء رقم 14).هامبورغ: إيبندورف ؛2013.

فيانا آر في ، واليس سي إل.الممارسات المخبرية السريرية الجيدة (GCLP) للاختبارات الجزيئية المستخدمة في المعامل التشخيصية ، في: Akyar I ، محرر.أطياف واسعة لمراقبة الجودة.رييكا ، كرواتيا: Intech ؛2011: 29-52.