Molekulêre opsporingsmetodes het die vermoë om 'n groot volume nukleïensuur te produseer deur die amplifikasie van spoorhoeveelhede wat in monsters gevind word.Alhoewel dit voordelig is om sensitiewe opsporing moontlik te maak, stel dit ook die moontlikheid van kontaminasie deur die verspreiding van amplifikasie-aërosols in die laboratoriumomgewing bekend.Wanneer eksperimente uitgevoer word, kan maatreëls getref word om die kontaminasie van reagense, laboratoriumtoerusting en bankspasie te vermy, aangesien sodanige kontaminasie vals-positiewe (of vals-negatiewe) resultate kan genereer.

Om die waarskynlikheid van kontaminasie te help verminder, moet Goeie Laboratoriumpraktyk te alle tye uitgeoefen word.Spesifiek moet voorsorgmaatreëls getref word ten opsigte van die volgende punte:

1. Hantering van reagense
2. Organisasie van werkspasie en toerusting
3. Gebruik en skoonmaakadvies vir die aangewese molekulêre ruimte
4. Algemene molekulêre biologie advies
5. Interne beheermaatreëls
6. Bibliografie

1. Hantering van reagense

Sentrifugeer kortliks reagensbuise voor oopmaak om die generering van aërosols te vermy.Aliquot reagense om veelvuldige vries-ontdooiings en die kontaminasie van meestervoorrade te vermy.Merk en dateer alle reagens- en reaksiebuise duidelik en hou logboeke by van reagenslot- en joernaalnommers wat in alle eksperimente gebruik is.Pipetteer alle reagense en monsters met behulp van filterpunte.Voor aankoop, is dit raadsaam om met die vervaardiger te bevestig dat die filterpunte pas by die handelsmerk pipet wat gebruik moet word.

2. Organisasie van werkspasie en toerusting

Werkspasie moet georganiseer word om te verseker dat die vloei van werk in een rigting plaasvind, van skoon areas (voor-PKR) tot vuil areas (na-PKR).Die volgende algemene voorsorgmaatreëls sal help om die kans op kontaminasie te verminder.Het aparte aangewese kamers, of ten minste fisies aparte areas, vir: meestermengsel voorbereiding, nukleïensuurekstraksie en DNA-sjabloon byvoeging, amplifikasie en hantering van geamplifiseerde produk, en produkontleding, bv. jelelektroforese.

In sommige instellings is dit moeilik om 4 aparte kamers te hê.'n Moontlike maar minder wenslike opsie is om die meestermengselvoorbereiding in 'n inperkingsarea te doen, bv. 'n laminêre vloeikas.In die geval van geneste PCR amplifikasie, moet die voorbereiding van die meestermengsel vir die tweede rondte reaksie voorberei word in die 'skoon' area vir meestermengsel voorbereiding, maar die inenting met die primêre PCR produk moet in die amplifikasie kamer gedoen word, en indien moontlik in 'n toegewyde inperkingsarea (bv. 'n laminêre vloeikas).

Elke kamer/area benodig 'n aparte stel duidelik benoemde pipette, filterpunte, buisrakke, draaikolke, sentrifuges (indien van toepassing), penne, generiese laboratoriumreagense, laboratoriumjasse en bokse handskoene wat by hul onderskeie werkstasies sal bly.Hande moet gewas word en handskoene en laboratoriumjasse moet verander word wanneer tussen die aangewese areas beweeg word.Reagense en toerusting moet nie van 'n vuil area na 'n skoon area verskuif word nie.Sou 'n uiterste geval ontstaan ​​waar 'n reagens of stuk toerusting agteruit geskuif moet word, moet dit eers met 10% natriumhipochloriet ontsmet word, gevolg deur 'n afvee met steriele water.

Let wel

Die 10% natriumhipochlorietoplossing moet daagliks vars aangemaak word.Wanneer dit vir dekontaminasie gebruik word, moet 'n minimum kontaktyd van 10 minute nagekom word.
Alternatiewelik kan kommersieel beskikbare produkte wat bekragtig is as DNS-vernietigende oppervlak-ontsmettingsmiddels gebruik word indien plaaslike veiligheidsaanbevelings nie die gebruik van natriumhipochloriet toelaat nie of as natriumhipochloriet nie geskik is om die metaaldele van toerusting te dekontamineer nie.

Ideaal gesproke moet personeel by die eenrigting-werkvloei-etos hou en nie op dieselfde dag van vuil areas (na-PKR) na skoon areas (voor-PKR) teruggaan nie.Daar kan egter geleenthede wees wanneer dit onvermydelik is.Wanneer so 'n geleentheid hom voordoen, moet personeel sorg om hande deeglik te was, handskoene te ruil, die aangewese laboratoriumjas te gebruik en geen toerusting wat hulle weer uit die kamer sal wil neem, soos laboratoriumboeke, inbring nie.Sulke beheermaatreëls moet beklemtoon word in personeelopleiding oor molekulêre metodes.

Na gebruik moet bankruimtes skoongemaak word met 10% natriumhipochloriet (gevolg deur steriele water om oorblywende bleikmiddel te verwyder), 70% etanol, of 'n gevalideerde kommersieel beskikbare DNA-vernietigende ontsmettingsmiddel.Ideaal gesproke moet ultraviolet (UV) lampe aangebring word om dekontaminasie deur bestraling moontlik te maak.Die gebruik van UV-lampe moet egter beperk word tot geslote werksareas, bv. veiligheidskaste, om die laboratoriumpersoneel se UV-blootstelling te beperk.Volg asseblief die vervaardiger se instruksies vir UV-lampversorging, ventilasie en skoonmaak om te verseker dat lampe doeltreffend bly.

As 70% etanol in plaas van natriumhipochloriet gebruik word, sal bestraling met UV-lig nodig wees om die dekontaminasie te voltooi.
Moenie die draaikolk skoonmaak en sentrifugeer met natriumhipochloriet nie;vee eerder af met 70% etanol en stel dit bloot aan UV-lig, of gebruik 'n kommersiële DNS-vernietigende dekontaminant.Vir mors, raadpleeg die vervaardiger vir verdere skoonmaakadvies.As vervaardiger se instruksies dit toelaat, moet pipette gereeld gesteriliseer word deur outoklaaf.Indien pipette nie geoutoklaveer kan word nie, behoort dit voldoende te wees om dit skoon te maak met 10% natriumhipochloriet (gevolg deur 'n deeglike afvee met steriele water) of met 'n kommersiële DNS-vernietigende ontsmettingsmiddel gevolg deur UV-blootstelling.

Skoonmaak met hoë-persentasie natriumhipochloriet kan uiteindelik pipetplastiek en metale beskadig indien dit gereeld gedoen word;gaan eers die aanbevelings van die vervaardiger na.Alle toerusting moet gereeld gekalibreer word volgens die vervaardiger-aanbevole skedule.'n Aangewese persoon moet in beheer wees om te verseker dat die kalibrasieskedule nagekom word, gedetailleerde logs bygehou word en diensetikette duidelik op toerusting vertoon word.

3. Gebruik en skoonmaakadvies vir die aangewese molekulêre ruimte

Pre-PCR: Reagens aliquoting / mastermix voorbereiding: Dit moet die skoonste van alle ruimtes wees wat gebruik word vir die voorbereiding van molekulêre eksperimente en moet ideaal gesproke 'n aangewese laminêre vloeikas wees wat toegerus is met 'n UV-lig.Monsters, onttrekte nukleïensuur en geamplifiseerde PCR-produkte moet nie in hierdie area gehanteer word nie.Amplifikasie-reagense moet in 'n vrieskas (of yskas, soos volgens vervaardiger se aanbevelings) in dieselfde aangewese spasie gehou word, ideaal langs die laminêre vloeikas of pre-PCR area.Handskoene moet elke keer verander word wanneer u die voor-PCR-area of ​​laminêre vloeikas binnegaan.

Die pre-PCR area of ​​laminêre vloeikas moet soos volg voor en na gebruik skoongemaak word: Vee alle items in die kas af, bv. pipette, puntbokse, draaikolk, sentrifuge, buisrakke, penne, ens. met 70% etanol of 'n kommersiële DNA-vernietigende dekontaminant, en laat droog word.In die geval van 'n geslote werksarea, bv. 'n laminêre vloeikas, stel die kappie bloot aan UV-lig vir 30 minute.

Let wel

Moenie reagense aan UV-lig blootstel nie;skuif hulle eers in die kas as dit skoon is.As u omgekeerde transkripsie PCR uitvoer, kan dit ook nuttig wees om oppervlaktes en toerusting af te vee met 'n oplossing wat RNases afbreek tydens kontak.Dit kan help om vals-negatiewe resultate van ensiemafbraak van RNA te vermy.Na ontsmetting en voordat die meestermengsel voorberei word, moet handskoene weer verander word, en dan is die kas gereed om te gebruik.

Pre-PKR: Nukleïensuurekstraksie/sjabloontoevoeging:

Nukleïensuur moet in 'n tweede aangewese area onttrek en hanteer word, deur 'n aparte stel pipette, filterpunte, buisrakke, vars handskoene, laboratoriumjasse en ander toerusting te gebruik. Hierdie area is ook vir die byvoeging van sjabloon, kontroles en tendenslyne by die mastermix buise of plate.Om besoedeling van die onttrekte nukleïensuurmonsters wat ontleed word te vermy, word dit aanbeveel om handskoene te vervang voordat positiewe kontroles of standaarde hanteer word en om 'n aparte stel pipette te gebruik.PCR-reagense en geamplifiseerde produkte moet nie in hierdie area gepipetteer word nie.Monsters moet in aangewese yskaste of vrieskaste in dieselfde area gestoor word.Die voorbeeldwerkspasie moet op dieselfde manier as die meestermengselspasie skoongemaak word.

Post-PCR: Amplifikasie en hantering van die versterkte produk

Hierdie aangewese spasie is vir post-amplifikasieprosesse en moet fisies geskei wees van die pre-PKR-areas.Dit bevat gewoonlik termosikleerders en intydse platforms, en moet ideaal 'n laminêre vloeikas hê om die ronde 1 PCR-produk by die rondte 2-reaksie te voeg, indien geneste PCR uitgevoer word.PKR-reagense en onttrekte nukleïensuur moet nie in hierdie area hanteer word nie aangesien die risiko van kontaminasie hoog is.Hierdie area moet 'n aparte stel handskoene, laboratoriumjasse, plaat- en buisrakke, pipette, filterpunte, houers en ander toerusting hê.Buise moet gesentrifugeer word voor oopmaak.Die voorbeeldwerkspasie moet op dieselfde manier as die meestermengselspasie skoongemaak word.

Post-PCR: Produkanalise

Hierdie kamer is vir produkopsporingstoerusting, bv. gelelektroforese tenks, kragpakke, UV-transilluminator en die geldokumentasiestelsel.Hierdie area moet aparte stelle handskoene, laboratoriumjasse, plaat- en buisrakke, pipette, filterpunte, houers en ander toerusting hê.Geen ander reagense kan in hierdie area ingebring word nie, behalwe laaikleurstof, molekulêre merker en agarosegel, en bufferkomponente.Die voorbeeldwerkspasie moet op dieselfde manier as die meestermengselspasie skoongemaak word.

Belangrike nota

Ideaal gesproke moet die voor-PKR-kamers nie op dieselfde dag betree word as daar reeds werk in die na-PKR-kamers uitgevoer is nie.As dit heeltemal onvermydelik is, maak seker dat hande eers deeglik gewas word en dat spesifieke laboratoriumjasse in die kamers gedra word.Laboratoriumboeke en papierwerk moet nie in die voor-PKR-kamers ingeneem word as dit in die na-PKR-kamers gebruik is nie;indien nodig, neem duplikaatdrukstukke van protokolle/monster-ID's, ens.

4. Algemene molekulêre biologie advies

Gebruik poeiervrye handskoene om toetsinhibisie te vermy.Korrekte pipettegniek is uiters belangrik om kontaminasie te verminder.Verkeerde pipettering kan lei tot spat wanneer vloeistowwe uitgegee word en die skep van aërosols.Goeie praktyk vir korrekte pipettering kan by die volgende skakels gevind word: Gilson-gids tot pipettering, Anachem-pipeteringstegniekvideo's, Sentrifugeerbuise voor oopmaak, en maak dit versigtig oop om spat te voorkom.Maak buise onmiddellik na gebruik toe om die inbring van kontaminante te vermy.

Wanneer verskeie reaksies uitgevoer word, berei een meestermengsel voor wat algemene reagense bevat (bv. water, dNTP's, buffer, primers en ensiem) om die aantal reagensoordragte te minimaliseer en die bedreiging van kontaminasie te verminder.Dit word aanbeveel om die meestermengsel op ys of 'n koue blok op te stel.Die gebruik van 'n Hot Start-ensiem kan help om die produksie van nie-spesifieke produkte te verminder.Beskerm reagense wat fluoresserende probes bevat teen lig om agteruitgang te voorkom.

5. Interne beheermaatreëls

Sluit goedgekarakteriseerde, bevestigde positiewe en negatiewe kontroles in, tesame met 'n geen-sjabloonkontrole in alle reaksies, en 'n meerpunt-getitreerde tendenslyn vir kwantitatiewe reaksies.Die positiewe beheer moet nie so sterk wees dat dit 'n kontaminasierisiko inhou nie.Sluit positiewe en negatiewe ekstraksiekontroles in wanneer nukleïensuurekstraksie uitgevoer word.

Dit word aanbeveel dat duidelike instruksies in elk van die areas geplaas word sodat gebruikers bewus is van gedragsreëls.Diagnostiese laboratoriums wat baie lae vlakke van DNS of RNA in kliniese monsters opspoor, sal dalk die bykomende sekuriteitsmaatreël wil gebruik om aparte lughanteringstelsels te hê met effens positiewe lugdruk in die voor-PKR-kamers en effens negatiewe lugdruk in die post-PKR-kamers.

Laastens is dit nuttig om 'n gehalteversekeringsplan (QA) te ontwikkel.So 'n plan moet lyste van reagensmeestervoorraad en werkvoorraad insluit, reëls vir die berging van kits en reagense, verslagdoening van kontroleresultate, personeelopleidingsprogramme, foutopsporingsalgoritmes, en regstellende aksies wanneer nodig.

6. Bibliografie

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Hoofstuk 3: Die opstel van 'n qPCR-laboratorium.'n Rigtingdokument vir die toets van ontspanningswaters deur gebruik te maak van USEPA qPCR-metode 1611. Lansing- Michigan State University.

Openbare Gesondheid Engeland, NHS.Britse standaarde vir mikrobiologie-ondersoeke: Goeie Laboratoriumpraktyke wanneer molekulêre amplifikasietoetse uitgevoer word).Gehalte leiding.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Die opstel van 'n PCR-laboratorium.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Roetine-instandhouding van sentrifuges: skoonmaak, instandhouding en ontsmetting van sentrifuges, rotors en adapters (Witskrif No. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Goeie Kliniese Laboratoriumpraktyke (GCLP) vir molekulêre gebaseerde toetse wat in diagnostiese laboratoriums gebruik word, In: Akyar I, redakteur.Wye spektrum van gehaltebeheer.Rijeka, Kroasië: Intech;2011: 29–52.